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牛病毒性腹泻病诊断技术的研究进展

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志发布时间:2018-09-12作者:admin浏览次数:101

1 聚合酶链式反应技术


1.1 PCR检测BVDV的研究进展


聚合酶链式反应(polymerase chain reacition,PCR)是一种用于放大快速扩增特定核酸片段的分子生物学技术。如今PCR技术已发展到第3代,在短短30年内已被广泛用于病毒、细菌等多种病原微生物的检测。


1.2  PCR技术的优缺点


随着PCR技术的广泛应用,其技术本身的缺陷也越来越明显$如配制PCR体系移液时易受环境污染,扩增结果出现假阳性或假阴性,特别是只能等到反应结束后再检测等问题。随着科技的不断发展,希望有更先进的技术来弥补PCR技术。


2 实时荧光定量PCR技术


2.1 实时荧光定量PCR检测BVDV的研究进展


实时荧光定量PCR(rel-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR),通过检测反应过程中荧光信号的变化来获得阈值循环(Ct)值和标准曲线,实现对起始模板的绝对定量或相对定量,在PCR仪运行期间采集数据并用SDS软件分析的一种PCR技术。qPCR技术自建立以来,已经在动物疫病检测、食品安全、科学研究及其他行业等领域中被广泛应用。


2.2 实时荧光定量PCR技术的优缺点


qPCR技术拥有PCR的高灵敏性,又融合了DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,在目的基因扩增时一直处于实时监控之中,扩增反应用Ct值来描述,试验结果在反应结束后即可直接获得,这有效解决了传统PCR只能在凝胶电泳后获得结果的局限性。 同时反应一直在封闭的环境中进行,在不开盖的情况下就可以获得结果,避免了污染。但该技术也存在一定问题,如标准品和样品间背景的不同将引入偏差,并且影响PCR的扩增效率;低拷贝数的目标DNA分子通过扩增不能被检测到;在提取DNA时混入其他溶液的DNA杂质,或者DNA降解就会影响PCR的动态扩增过程;荧光探针或染料易受光线污染而使试验结果受到影响。由于qPCIR需要在实时荧光PCR仪中进行,并且无法在基层大面积推广,所以就需要新的诊断技术弥补这些不足,环介导等温扩增技术的发明解决了这一问题。


3 环介导等温扩增技术


3.1 环介导等温扩增技术检测BVDV的研究进展


环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增方法,也叫环形核酸扩增法。该技术适用于各种基因的体外诊断。该方法主要根据特异性识别目标靶序列上6个区域,再根据区域设计4种特异性引物,利用自动循环的链置换反应,同时应用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下(60∽65℃)孵育20∽60 min,完成对靶目标序列1*109∽1*1010个数量级的扩增。


3.2 环介导等温扩增技术的优缺点


与普通PCR比较,环介导等温扩增技术省去了PCR操作和反应的繁琐过程,操作简单快捷;与qPCR技术的必须使用荧光定量PCR仪相比,该技术的优势既融合了pPCR特异性和灵敏度高,又对反应仪器要求较低,结果的判定也很简单,通过离心后肉
眼观察是否有白色沉淀,或者直接看有无绿色荧光的生成来判断,更适合基层快速诊断疫病。

4 数字PCR技术


4.1 数字PCR检测技术的研究进展


数字PCR(digital plymerase chain reaction,dPCR)技术是由.Vogelstein等提出的一种新的核酸检测方法,该技术于扩增前对反应管中反应体系在芯片上进行微滴化处理,将反应体系中的核酸分子分成约20 000个体积为1 μ的独立反应室,每个独立反应室微滴经dPCR仪扩增后,利用芯片检测仪再逐个对每个芯片进行扫描检测,最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数,通过相应的软件分析就可以给出原始待测样品中的目标DNA分子的绝对定量起始拷贝数及浓度。微滴式数字PCR为DNA的临床诊断精确量化提供了新的平台,由于它的数字性质,越来越受到研究人员的欢迎,与传统实时PCR相比,它提供了更准确的量化和更高的灵敏度。因此,dPCR非常适合用于疾病的早期诊断。


4.2 数字PCR技术的优缺点


dPCR能对核酸分子进行绝对定量检测,且具有精确性高、灵敏度强、节省时间和试剂以及操作简单的优点,可以广泛用于生物含量的分析和疫病临床检测。与普通PCR 相比,dPCR的整个操作过程和反应都在密闭的芯片内部进行,扩增反应后直接进行检测,不需要开启反应容器,明显减少了移液操作造成的浪费,同时避免了操作引起的污染。与qPCR相比,dPCR作为 DNA 定量的新技术,克服了qPCR的一系列缺点,实现了单分子DNA的绝对定量,解决了qPCR依赖扩增曲线的循环阈值对测量结果产生影响等问题,并可减少qPCR 带来的基体效应dPCR LAMP比较,在数字芯片上还可进行核酸等温扩增反应,等温核酸扩增操作简单快捷,扫描完芯片就可以直接读取结果并判定。


防控BVD的关键是预防加诊断。预防主要依靠疫苗,但目前尚无安全、有效的疫苗防治该病,因此BVDV的诊断特别是快速诊断就尤为关键。快速诊断技术中首推的是分子生物学技术,PCRqPCR、环介导等温扩增等技术已在BVDV诊断中得到大量应用,而dPCR尚未应用于BVDV的检测中,但给快速诊断BVDV提供了新的思路和方法。期望在不远的将来,有更多更好的分子生物学技术能用于BVDV的检测。


段进刚,雷程红*,葛  婷,阿热阿依·海依拉提,卞赛赛,高  窦,代 

(新疆农业大学 动物医学学院,乌鲁木齐  830052




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