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一种基于ITR序列的羊痘病毒TaqMan探针荧光PCR检测方法的建立

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志发布时间:2018-10-10作者:admin浏览次数:145

试验根据羊痘病毒[绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)]末端反向重复(ITR)序列的保守区设计了1对特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件建立了一种检测羊痘病毒的TaqMan探针荧光PCR检测方法。结果表明:该方法对羊痘病毒具有良好的特异性,不与猪痘病毒(SWPV)、鸡痘病毒(FPV)、羊传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)及口蹄疫病毒(FMDV)发生交叉反应。该方法对质粒标准对照(pCR-GPTV-ITR)的最适线性检测范围为2.3×101~2.3×108拷贝/μL,标准曲线方程为Y=-3.416 2X+38.605,相关系数(R2)为0.999 9,检测下限为23拷贝数。对3个不同浓度的pCR-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验检测,每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。

由于常规的病毒分离鉴定和血清学试验不适于羊痘的早期快速诊断,因此建立快速、敏感和准确的病原检测方法,对有效控制羊痘、减少经济损失是十分必要的。已知羊痘病毒基因组为长约150 kb、末端闭合的双股DNA,其两端为反向重复序列,中间区域为包含147个开放阅读框(ORF)的编码区。理论上,一个羊痘病毒基因组DNA含有2个拷贝的ITR序列和1个拷贝的病毒蛋白编码基因。近年来,国内外学者基于羊痘病毒基因组中间区域的不同病毒结构蛋白的编码基因序列建立了多种检测羊痘病毒的荧光PCR方法。康文玉等以GTPV的P32蛋白基因为靶基因建立了检测山羊痘的TaqMan探针荧光PCR方法。C.A.Balinsky等基于SPPV的O68基因建立了检测绵羊痘临床样本的TaqMan-MGB荧光PCR方法。程振涛等以GPTV基因组gp064基因为靶基因,建立了检测山羊痘的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法。C.E.Lamien等基于GPTV Pellor 株的G蛋白偶联趋化因子受体(GPCR)基因序列,建立了双水解探针检测羊痘病毒的荧光PCR方法。本研究利用羊痘病毒基因组ITR序列的双拷贝特性及其保守区域,设计了特异引物及TaqMan探针,通过优化反应条件建立了一种快速检测羊痘病毒的TaqMan探针荧光PCR方法。试验结果表明,该方法具有很高的特异性、敏感性和可重复性,对实际临床样本的检测结果证明该方法可用于羊痘的早期快速诊断。

王建华1,李  宁2,赵祥平1,贺  艳 1,郑文杰1,刘  伟
(1.天津出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心,天津 300456;2.中国兽药监察所,北京 100100)




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