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寒地养殖
Cold farming

猪圆环病毒Ⅰ型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2017-12-19作者:admin浏览次数:363

                                                原 霖1,2,陈亚娜1,翟新验1

            (1.中国动物疫病预防控制中心 OIE猪繁殖与呼吸综合征参考实验室,北京 102618;2.中国农业大学 动物医学院,北京 100193)

          1974年,猪圆环病毒(PCV)被发现于 PK-15猪肾细 胞 系 中 (ATCC CCL-33)[1-2],可 持 续 感 染PK-15细胞但不引起细胞病变,将其命名为猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)。血清学调查结果显示,在世界范围内 PCV-1广泛存在于猪群中但不引起发病。我国学者也在多地猪群中分离得到 PCV-1[3-5]。随后发现猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)与断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)相关。PCV-1和 PCV-2均为单股环状 DNA病毒,长度约为 1.7kb,两者核苷酸序列具有 80%的同源性。尽管 PCV-1不引起猪群发病,但是被 PCV-1污染的 ST猪睾丸细胞、PK-15猪肾细胞系及其他猪源产品被广泛用于制备兽用及人用疫苗。近年来,有学者在美国 FDA认证的人用轮状病毒疫苗中检测出PCV-1的核苷酸[6-7],使得人们开始重视 PCV-1的污染问题。有学者在 11种商品化针对猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病毒(PRV)的猪用疫苗中,检测出有 7种疫苗含有 PCV-1DNA,表明这7种疫苗被 PCV-1DNA污染[8]。目前,国内仅有 PCV-1的普通 PCR检测方法,操作复杂,灵敏度低。因此,建立更加快速准确检测 PCV-1病毒的方法显得尤为重要。本试验建立了针对 PCV-1的荧光定量 PCR方法,旨在用于 PCV-1的流行病学调查、疫苗质控及其他 PCV-1相关研究的检测,现将结果报道如下。

       1 材料与方法

       1.1 毒株、病料猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、CSFV、PPV、PRV、PCV-1、PCV-2,均由中国动物疫病预防控制中心分离、保存。20份病料,为来自临床的猪组织样品。

        1.2 主要仪器与试剂实时荧光定量 PCR仪,购自 LIFE公司;核酸蛋白分析仪,购自 ThermoFisher公司;凝胶成像系统,购自美国伯乐公司;核酸提取试剂盒,购自 QIAGEN公司;实时荧光一步法 RT-PCR试剂盒,购自 Promega公司、T3克隆载体,购自北京全式金生物技术有限公司。

       1.3 引物、探针的设计登录 GenBank的 PCV-1基因组序列,根据PCV-1病毒 ORF1基因保守区,应用 PrimerExpress3.0软件设计引物和特异性探针。引物、探针由英潍捷基有限公司合成。引物、探针序列见表 1。

 

       1.4 标准品质粒的制备以 PCV-1病毒核酸为模板,使用表 1中普通PCR引物进行扩增。将扩增产物连接至 pEASY-T3载体,然后转化至 TransT1感受态细胞,筛选出含有阳性重组质粒的细菌进行测序鉴定。对鉴定正确的细菌进行培养,提取含 PCV-1全长基因的质粒。应用核酸蛋白分析仪测定质粒在 260nm波长处的吸光度值,读取 OD260/OD280比值和浓度,根据公式 y(copies/μL)=[x(ng/μL)×10-9/(DNA长度 ×660)]× 6.02×1023计算质粒浓度的拷贝数。

      1.5 引物探针浓度的优化以 PCV-1质粒为模板进行引物与探针浓度的优化。选取的探针浓度为 100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L,引物浓度为 400μmol/L、600μmol/L、900μmol/L,根据矩阵法组合不同引物与探针浓度进行荧光定量 PCR检测,根据循环阈值(Ct值)与信号强度选取最优的引物、探针浓度组合。扩增条件为:95℃ 2min;95℃ 15s,60℃ 1min,共 40个循环。

      1.6 标准曲线的建立与最低检测限以 PCV-1质粒为标准品进行 10倍倍比稀释。以模板拷贝数的对数为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线。以倍比稀释后的 PCV-1质粒作为模板,按照已建立的荧光定量 PCR方法绘制标准曲线,计算出最低检测限的拷贝数。

     1.7 特异性和重复性试验以 PRRSV美洲型毒株 VR2332株、变异毒株JXA1株及 CSFV、PPV、PRV、PCV-2、PCV-1为模板,按照已建立的荧光定量 PCR方法进行特异性检测。取 1份阳性样品,按照已建立的荧光定量 PCR方法进行 3次重复性检测,根据标准曲线与 Ct值计算变异系数。

     1.8 PCV-1荧光定量 PCR与普通 PCR比较和对临床样品的检测使用建立的 PCV-1荧光定量 PCR方法和普通PCR方法同时对 20份病料进行检测,比较两者的结果。

     2 结果与分析

     2.1 PCV-1全基因质粒 DNA浓度的测定经核酸蛋白分析仪测定,质粒浓度为134.9μg/mL,OD260/OD280值为 1.82,纯度较高。根据计算公式算出 PCV-1质粒浓度为 2.76×1010copies/μL。

      2.2 引物探针浓度的测定经 对 不 同 引 物、探 针 浓 度 的 测 试,得 出300μmol/L的探针浓度和 600μmol/L的引物浓度Ct值最低,荧光强度最强。

      2.3 标准曲线与最低检测限的确定以 10倍倍比稀释的 PCV-1质粒为模板进行荧光定量 PCR扩增,得到荧光定量 PCR扩增曲线,见图 1,以标准品拷贝数的对数为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线,标准曲线方程为 y=-3.209x+37.513,见图2。标准曲线的相关系数(R2)为0.997,呈良好的线性关系。扩增效率为 104.92%,扩增效率较高。荧光定量 PCR方法最低可检测到 5.12copies/μL。

     2.4 重复性试验以 1份 PCV-1阳性样品为模板,用已建立的荧光定量 PCR方法进行扩增,重复 3次。Ct值分别是18.12,17.65,17.85;变异系数为 1.3%,小于 2%,说明该方法重复性良好。

     2.5 特异性试验对 PRRSV美洲型毒株 VR2332株、变异毒株JXA1株及 CSFV、PPV、PRV、PCV-2、PCV-1进行荧光定量 PCR检测,结果仅 PCV-1出现的荧光信号有扩增曲线,其他均无非特异性扩增,见图 3,说明建立的荧光方法有良好的特异性。

      2.6 PCV-1荧光定量 PCR与普通 PCR比较和对临床样品的检测结果已建立的荧光定量 PCR方法最低可检测到5.12copies/μL,而普通 PCR方法用 PCV-1国家标准引物最低可检测到51.2copies/μL,荧光定量 PCR方法的灵敏度是国家标准普通 PCR方法的 10倍。对临床样品的检测结果显示,20份样品中荧光定量PCR方法检出的 PCV-1阳性为 14份,普通 PCR方法检出的 PCV-1阳性也为 14份,两者符合率为100%。

      3 讨论由于荧光定量 PCR方法的检测灵敏度高,可以实现相对定量等优点,已经广泛用于动物疫病的诊断检测[9]。由于 PCV-1临床不发病,对于 PCV-1的荧光定量 PCR方法的报道相对较少。张福良等[10]建立了基于 taqman探针用于检测 PCV-1的荧光定量 PCR方法,其灵敏度可达 10copies/μL。B.C.Yang等[8]建立了基于 SYBRgreenⅠ技术的用于检测PCV-1的荧光定量 PCR方法,灵敏度可达 100cop ·170· 总第 525期ies/μL。于红欣等[11]建立了基于 SYBRgreenⅠ的猪圆环病毒Ⅰ型的 real-timePCR检测方法,其最低可检测到 320copies/μL的核酸模板。本研究建立的荧光定量 PCR方法的灵敏度可达 5.12copies/μL,高于其他文献报道的方法,并且本研究将建立的荧光定量PCR方法与国家标准 GB/T21674—2008《猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法》进行了比较,结果灵敏度高于国家标准 PCR方法的 10倍。通过对临床样品的检测,两者符合率 100%。本研究建立的 PCV-1荧光定量 PCR方法可用于测定动物器官及含猪源成分产品中 PCV-1含量、流行病学调查及其他 PCV-1相关研究。

 

 

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