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寒地养殖
Cold farming

口蹄疫病毒real-timeRT-RPA检测方法的建立与应用

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2017-12-25作者:admin浏览次数:479

                        杨 洋,秦晓东,宋一鸣,施冲旭,李彦敏,张志东

    (中国农业科学院 兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046)

      口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是一种主要发生在牛、羊、猪等偶蹄动物的动物疫病,其传播速度快、感染率高,被世界动物卫生组织(OfficeInternationaldesEpizooties,OIE)列为法定必报的传染病,被我国列为一类动物传染病[1-3]。该病病原为口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV),是微 RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员。该病毒存在 A型、O型、Asia1型、C型、南非 1型、南非 2型和南非 3型等 7个 血 清 型[4]。FMDV 基 因 组 是 大 小 约 为8.5kb的单股正链 RNA,翻译产物可以裂解成 4种结构蛋白和 15种非结构蛋白[5-7],其中 3D是一种保守的非结构基因,常被用作分子诊断方法[8-9]。PCR是检测 FMDV的常用方法,但该方法需要昂贵的热循环仪器及熟练的操作人员,难以用于现场诊断 及 试 验 条 件 差 的 地 方。重 组 酶 聚 合 酶 扩 增(recombinasepolymeraseamplification,RPA)是一种新的核酸检测方法,能在 37~42℃ 恒温条件下 20min内完成检测,特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA技术已被成功应用到多种病原的检测上,如牛冠状病毒(Bovinecoronavirus)[10]、施马伦贝格病毒(Schmallenbergvirus)[11]、牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus)[11]、黄热病毒(Yellowfevervirus)[12]、登革热病毒(Denguevirus)[13]、流感病毒(H5N1和 H7N9)[14-15]和羊口疮病毒(Orfvirus)[16-17]。本研究建立了一种快速检测FMDV的基于荧光探针的反转录重组酶聚合酶扩增反应(FMDVreal-timeRT-RPA)。首先筛选最佳的引物和探针组合,随后对该方法的敏感性、特异性、重复性进行评价,最后用临床样品对该方法进行评价,并将此结果与相对应 RT-qPCR结果进行比较,现将结果报道如下。

        1 材料与方法

        1.1 病毒和细胞FMDV/Asia-1/JS/05、FMDV/A/Hubei/05及FMDV/O/ON/CHA毒株,均由国家口蹄疫参考实验室保存;FBS(批号为 1618863,500mL)和 DMEM(批号为 8116175,500mL),均购自 Iifetechnology公司。BHK-21细胞培养基为含有 10% FBS的 DMEM培养液,在含 5% CO2的 37℃恒温培养箱中培养。

       1.2 样品准备FMDV阳性样品来自于感染 FMDV/Asia-1/JS/05毒株、FMDV/A/Hubei/05毒株不同时间的猪;FMDV阴性样品来自于健康猪。以上所有动物的饲养、病毒感染及采样均在兰州兽医研究所 P3动物舍中进行。

       1.3 RNA提取采用高纯度病毒核酸提取试剂盒提取 RNA,提取过程按照试剂盒说明书进行,并最终洗脱至 50μL。提取的 RNA于 -80℃低温冰箱中冻存,备用。

       1.4 RNA标准品的制备将合成的 FMDV3D基因片段(310bp)克隆到pUC57载体,位于 T7启动子的下游,命名为 pFMDV/RPA。按照体外转录操作手册对 1μg线性化的质粒进行体外转录。用 DNase处理转录后的 RNA,随后按照 RNA清洁操作手册操作,再用 Nanovue定量纯化 RNA,并于 -80℃保存,备用。

       1.5 RT-RPA引物和探针设计FMDV特异性 RT-RPA引物和探针基于高度保守的 3D序列,根据 Twist引物和探针设计指南设计。所有的引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。探 针 上 有 荧 光 集 团 [6-carboxyfluorescein(FAM)]、淬灭集团(BHQ-1)、垫片(THF)及封闭延伸[phosphate(P)]4种修饰。

      1.6 RT-qPCRRT-qPCR试验在安捷伦 Mx3005P实时荧光定量 PCR仪中进行,引物和探针序列:上游引物 5′-ACTGGGTTTTAYAAACCTGTGATG- 3′,下 游 引 物5′-TCAACTTCTCCTGKATGGTCCCA- 3′,特异性FAM-MGB探针 5′-ATCCTCTCCTTTGCACGC -3′。反应条件参照参考文献[8]。

      1.7 FMDVreal-timeRT-RPAFMDVreal-timeRT-RPA反应体系:27.5μL水解缓冲液,10μmol/L的 RPAexo探针 0.6μL,10μmol/L的上、下游引物各 2.1μL,模板 2μL,ddH2O11.2μL,280mmol/L的醋酸镁 2.5μL。该反应在安捷伦 Mx3005P实时荧光定量 PCR仪中进行,反应条件为 40℃ 10s,共 60组反应。该试验在20min以内完成。

     1.8 统计学分析试验数据均用“平均值 ±标准差”表示,所有统计试验均用 PRISM5.0(GraphPad)软件和 Excel软件完成。

      2 结果与分析

      2.1 FMDVreal-timeRT-RPA试验敏感性和特异性测定首先,为了确定 FMDVreal-timeRT-RPA试验最佳的扩增效率,基于 FMDV3D基因设计了 3条上游引物(F1~F3)、3条下游引物(R1~R3)和探针,见表 1。随后检测 9种不同引物组合(如 F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2/R3、F3/R1、F3/R2、F3/R3)与探针结合的扩增效率,扩增结果表明,F1/R1引物对和探针结合可产生最强的扩增效率。因此,在以后的试验中均使用该对引物进行 FMDVreal-timeRT-RPA试验。

为了检测 FMDVreal-timeRT-RPA反应的敏感性,用标准 RNA进行 10倍倍比稀释,分别稀释出浓度梯度为 5×106~5×101 个拷贝共计 6个梯度作为模板进行试验,每个试验重复 6次。反应在温度设定为 40℃的 qPCR仪中进行,时间设定为 20min,通过实时荧光检测监控扩增结果,见图 1。由图 1A可知,该反应的敏感性为 500拷贝/反应,并且具有较广的检测范围,至少在 5×106 ~5× 102个拷贝范围内的样品均能被检测出来。利用 PRISM5.0(GraphPad)软件对试验的可重复性及退行性进行统计分析,结果该方法具有很好的可重复性,检测极限为 500拷贝/反应,见图 1B、1C。分别用猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪 2型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV/Asia-1/JS/05、FMDV /A/Hubei/05、FMDVO/ON/CHA)进行 FMDVreal-timeRT-RPA特异性试验,结果见表 2。由表 2可知,3株不同血清型 FMDV均为阳性,而其他病毒则为阴性,说明该方法具有很好的特异性。

       2.2 临床样品的检测用临床样品对 FMDVreal-timeRT-RPA试验的可用性进行评价,并将结果与 RT-qPCR试验结果进行比较。临床样品包括43份感染 FMDV猪试验样品及 33份健康猪样品。结果表明,即使试验时间超过 30min,33份采自健康猪的样品均为阴性;而 43份感染 FMDV的猪样品全部为阳性[平均时间阈值为(7.5±1.6)min,范围为 5.00~9.66min],该试验结果与 RT-qPCR试验结果完全一致[平均 Ct阈值为(27.4±0.6),范围为 23~34)]。基于全部检测的76份样品,与 RT-qPCR试验比较,FMDVreal-time ·174· 总第 525期RT-RPA试验的敏感性和特异性均为 100%,结果见表 3。用 Excel软件对 FMDVreal-timeRT-RPA试验的时间阈值和 FMDVRT-qPCR试验的 Ct阈值进行相关性比较,见图 2,结果表明 real-timeRT-RPA试验与 RT-qPCR试验具有很好的相符性。

       3 讨论本研究建立了一种基于荧光探针的 RPA试验(FMDVreal-timeRT-RPA),试验使用的基于 FMDV3D基因的 F1/R1引物对与探针组合能特异性检测 FMDV。RT-RPA反应的一些优点使得其相比于传统扩增方法具有很大优势:1)反应混合物提前处理呈球状固体,并且真空包装;2)该试验可以在 37~45℃、20min内完成试验;3)RT-RPA提供了多种终点检测手段(如核酸电泳、荧光检测及试纸条),适用于不同实验室,使得 RT-RPA既可以在装备精良的实验室进行,也可以在移动实验室进行,还可以在不能 提 供 昂 贵 的 诊 断 仪 器 的 边 远 地 区 进 行[18]。LAMP是一种近年研究较多的等温扩增方法,并用于检测 FMDV[19-21]。与 RT-RPA相比较,LAMP需要3对引物,更高的反应温度(62℃),更长的扩增时间(60min)。因此,本研究建立的 FMDV real-timeRT-RPA试验比 LAMP更加简单和快速。该试验可以在 20min内获得试验结果,反应温度更低(39~42℃),具有开发为现场诊断方法的潜力。另外,与RT-qPCR类似,RT-RPA方法由于添加了特殊的探针使得其特异性更高,而 LAMP使用非特异性掺入染料使得其特异性相对较差。A.A.E.Wahed等[22]在 2013年建立了便携式反转录重组酶聚合酶反应以快速检测 FMDV,该试验能够在 20min内快速检测 1436个 RNA分子,并具有很好的特异性;但该方法的检测灵敏度比较低,并且国内没有相应的研究。为进一步提高该方法的灵敏度,本试验根据 O型 FMDVON毒株 3D序列保守区域设计 RPA引物和探针,结果表明,该试验显著提高了反应灵敏度,并同样具有很好的特异性。总之,本研究建立的 FMDVreal-timeRT-RPA试验能够在 20min内快速、特异地检测 FMDV,使其成为一种潜在的 FMDV快速检测方法,为临床诊断试剂盒的研发提供了数据支持。

 

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