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寒地养殖
Cold farming

猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与初步应用

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-29作者:admin浏览次数:112

       轮状病毒(Rotaviruses,RVs)中的A群、B群和C群已经被确认为是猪腹泻的重要病原,其中A群轮状病毒是猪群中最常见的引起腹泻性疾病的主要病原。幼龄仔猪最为易感,1~4周龄仔猪发病率超过80%,死亡率达7% ~20%,症状也较严重。同时,由于该病常与其他疾病混合感染,使病情加重,导致死亡率增高,给养殖户带来严重的经济损失。本研究根据猪A群轮状病毒的NSP4基因建立了一步法RT-PCR检测方法,为猪A群轮状病毒病的检测提供了技术支持。

      1材料

      1.1 样品

       猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒;猪瘟病毒活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗。

      1.2 主要试剂

      TRIzol® Reagent提取试剂盒、Prime ScriptTM one Step RT-RCR kit Ver.2试剂盒、DL-2000 Marker、溴化乙锭。

      1.3 引物

      根据GenBank上登录的猪A群轮状病毒的NSP4基因(登录号为KU363142.1)序列利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物。引物序列F:5'-GTGCGGAAAGATGGATAA-3';R:5'-CATTCGCTGGATTGGTTA-3'。扩增目的片段大小为683 bp。

      2方法

      2.1 RNA模板的制备

     取250 μL的样品加入750 μL TRIzol中,颠倒混匀后室温静置3~5 min;再加入250μL氯仿,混匀器上振荡混合15 s(也可以用手反复颠倒混匀),4 ℃下13 000 r/min 离心15 min;小心吸取约500 μL上清液转移至500 μL异丙醇中,颠倒混匀,室温下静置15 min,4 ℃下1 300 r/min 离心10 min;弃上清液,加入1 mL 75%的DEPC乙醇,4 ℃下13 000 r/min离心10 min,洗涤2次,干燥后用20 μL DEPC水溶解沉淀,-20 ℃保存,备用。

       2.2 一步法RT-PCR反应体系及反应程序

      采用50 μL反应体系,通过对RT-PCR反应体系及反应程序的优化,确定RT-PCR反应体系:2×1 Step Buffer 25 μL,RNase Free H2O 20 μL,20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL,模板2 μL。

     反应程序为:50 ℃反转录60 min,94 ℃预变性90 s;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃终延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭)电泳检测,然后用凝胶成像系统分析。

     2.3 特异性试验

      利用优化后的反应体系和反应程序对猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒进行检测,并设立无模板阴性对照。

     2.4 敏感性试验

     利用优化后的反应体系和反应条件,将猪A群轮状病毒的RNA进行10倍倍比稀释至1×10-5,即浓度分别为13 170,1 317,131.7,13.17,1.317,0.131 7 pg/μL,然后进行RT-PCR扩增,以检测该方法的敏感性。

     2.5 重复性与稳定性试验

     利用优化后的反应体系和反应程序,分3次提取猪A群轮状病毒的RNA,并平行进行3次RT-PCR扩增。

    2.6 临床应用

     应用建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法对临床腹泻样品进行检测,同时设立阳性对照、无模板阴性对照。并选取14份猪A群轮状病毒扩增阳性样品进行序列测定,并与NCBI上基因库进行序列同源性比较。

     3结果与分析

     3.1 扩增结果

    提取猪A群轮状病毒的RNA,进行RT-PCR扩增反应。结果显示RT-PCR可扩增出NSP4基因的目的条带,无模板阴性对照无目的条带。 

     3.2 特异性试验结果

     利用优化后的反应体系和反应程序对猪A群轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒进行检测。结果显示仅以猪A群轮状病毒的RNA为模板时能扩增出特异性目的条带。表明该方法具有较高的特异性,与其他病原无交叉反应。

      3.3 敏感性试验结果

     将猪A群轮状病毒的RNA进行10倍倍比稀释至1×10-5,进行PCR检测电泳检测结果显示最低可以检测到的浓度为13.17 pg/μL。

     3.4 重复性与稳定性试验结果

     3次平行RT-PCR扩增结果表明该方法具有良好的重复性与稳定性。

      3.5 临床样品检测结果

     应用建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法对30份临床腹泻样品进行检测,结果样品阳性率为90%(27/30)。同时选取14份猪A群轮状病毒扩增阳性样品进行序列测定,应用在线软件进行BLAST比对,结果发现测定序列与GenBank中的其他猪A群轮状病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。表明本试验建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法能够成功地用于临床样品的检测。

     4讨论

     动物疫病及时、准确的诊断是有效控制疫病蔓延的关键。随着分子生学技术的发展,越来越多的新技术被广泛应用于动物疫病诊断中,其中PCR技术是各种动物疫病诊断技术中应用最成熟的方法之一。本研究建立的猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法与一般RT-PCR方法相比,不仅操作简便,而且缩短了检测时间,提高了检测效率。本方法灵敏性高、特异性强、稳定性好。通过临床应用表明该方法可对A群轮状病毒做出准确的诊断,可以很好地应用于猪A群轮状病毒病的临床诊断。

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