您好,欢迎光临东北畜牧兽医网!

咨询热线:0451-82328863-807

您现在的位置:首页 > 寒地养殖 > 养猪 > 疾病诊治

寒地养殖
Cold farming

猪瘟病毒贵州分离株E2基因的克隆及同源性分析

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-02-05作者:admin浏览次数:740

      猪瘟病毒( Classical swine fever virus,CSFV) 是一种引起猪的急性、热性和高度接触性传染病病原,该传染病称为猪瘟(classical swine fever,CSF)。猪瘟对养猪业危害十分严重,被国际兽疫局(OIE)列为通报疫病之一,也是我国法定的一类动物疫病。目前,猪瘟已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》(2012—2020年)重点优先防治的疫病,到2020年全国所有种猪场达到净化标准。因此,如何合理实施规模化猪场猪瘟净化工作和按期实现净化目标,是兽医科技工作者和种猪场经营管理工作者需要共同应对的一个重要任务。本研究根据已建立的《猪瘟病毒及伪狂犬病病毒的净化方案》,对规模化猪场中经RT-PCR鉴定为CSFV阳性的样本进行毒株分离。由于猪瘟病毒E2蛋白是诱导产生保护性中和抗体的主要抗原结构蛋白,是猪瘟病毒主要的免疫相关基因,因此本试验以E2蛋白作为目的基因,通过对贵州大学动物疫病生物技术中心实验室分离保存的CSFV毒株的E2基因进行克隆及序列分析,以期为更好地阐明猪瘟病毒贵州分离株与参考毒株间的遗传演化关系,为追溯病毒的传播来源和更好地防控净化奠定基础。
      1 材料与方法

      1. 1 病毒
      本研究所用毒株为从贵州地区实行猪瘟净化过程中经RT-PCR鉴定为CSFV阳性的病料组织中分离得到的,将其命名为CSFV-GZA株。感染猪瘟病毒后猪的临床表征,见图1和图2。剖检情况见图3。

 

                                                                图1 发病猪全身大面积发绀 

      

                                                                      图2 阴户严重发绀

    1. 2 病毒RNA的提取

    按照 TRIzol LS Reagent 试剂盒使用说明书从细胞液中提取病毒 RNA。

 

    1. 3 E2基因的 RT-PCR 扩增

    按照 One Step RT-PCR Kit2.0 使用说明书,应用E2基因特异性引物进行猪瘟病毒E2基因扩增。

 

    1. 4 目的基因的克隆、鉴定与测序

    RT-PCR产物用胶回收试剂盒回收后与pMD19-T 载体连接,转化入Top10感受态细胞,筛选阳性菌落,提取重组质粒进行酶切及PCR鉴定,将鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。

 

      1. 5 序列分析

     利用DNAStar软件中MegAlign模块进行分子生物学分析。对猪瘟病毒贵州分离株CSFV-GZA的E2基因序列与GenBank中已发表的相关毒株的E2基因进行同源性分析,并构建遗传进化树。


      2 结果与分析


 

      2. 1 RT-PCR扩增

电泳结果显示,RT-PCR扩增片段大小与预期的目的条带大小相符。

 

      2. 2 质粒PCR产物鉴定

将筛选后的液体培养物进行质粒提取,以100倍稀释后的质粒为模板进行PCR扩增,得到与预期大小相符的目的条带,说明E2基因cDNA序列均插入到pMD19-T载体中。

 

      2. 3 序列测定与分析

CSFV-GZA株的E2基因全长核苷酸序列大小为1 137 bp。利用DNAStar软件中MegAlign模块对CSFV-GZA株E2基因序列与参考毒株的E2基因序列进行核苷酸同源性分析,结果贵州分离株CSFV-GZA株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD和意大利标准强毒株Brescia的同源性分别为84.3%、84.0%、83.9%和84.0%;与德国疫苗毒株Reims、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain和非洲疫苗株RUCSFPLUM的同源性分别为83.0%、83.0%和83.4%;与我国分离株CF114、C-ZJ-2008和CSFV-GZ-2009的同源性分别为84.4%、82.8%和84.4%。

应用DNAStar软件中MegAlign模块对CSFV-GZA株的E2基因核苷酸序列与参考毒株序列进行遗传进化树分析,结果CSFV-GZA株E2基因与国内外流行毒株关系较远,表明该病毒发生了某些位点变异。

  应用DNAStar软件中MegAlign模块对CSFV-GZA株E2基因序列与参考毒株的E2基因序列进行氨基酸同源性分析,结果贵州分离株CSFV-GZA株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD和意大利标准强毒株Brescia的同源性分别为90.6%、89.8%、89.5%和89.5%;与德国疫苗毒株Reims、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain和非洲疫苗株RUCSFPLUM的同源性分别为89.0%、89.0%和88.7%;与我国分离株CF114、C-ZJ-2008和GZ-2009的同源性分别为90.1%、89.0%和90.6%。


      3 讨论

本试验通过在对规模化种猪场进行净化过程中,从经RT-PCR鉴定为CSFV阳性的样本中分离出毒株,命名为CSFV-GZA,以其为研究对象,选择E2全基因作为猪瘟病毒贵州分离株序列分析与遗传分型的目的基因,并与我国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD、意大利标准强毒株Brescia、德国疫苗毒株Reims、我国的猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain、非洲疫苗株RUCSFPLUM以及我国分离株CF114、C-ZJ-2008和GZ-2009等进行同源性分析。核苷酸同源性分析结果表明,CSFV-GZA株与我国分离株CF114和GZ-2009的同源性最高同为84.4%,与3株疫苗株的同源性较低;氨基酸同源性分析结果表明,CSFV-GZA株与我国标准强毒株Shimen-HVRI和我国分离株GZ-2009的同源性最高为90.6%,与3株疫苗株同源性较低。本试验通过分子生物技术获得猪瘟病毒贵州分离毒株E2基因,应用分子克隆技术和生物信息学技术分析了贵州猪瘟病毒分离毒株与国内外毒株之间的关系,结果表明,猪瘟病毒贵州流行株与国内外毒株E2基因的核酸同源性差异较大,试验数据为猪场免疫猪瘟疫苗的选择提供了一定的参考依据,对贵州猪瘟病毒分子流行病学净化监测防控具有重要意义。

 

声明:东北畜牧兽医网刊登的文章仅代表作者个人观点,文章内容仅供参考,并不构成投资建议,据此操作,风险自担。如果转载文章涉嫌侵犯您的著作权,或者转载出处出现错误,请及时联系文章编辑进行修正。东北畜牧兽医网原创文章,转载请注明出处及作者。感谢您的支持和理解!
政策法规
国家政策法规
地方政策法规
客户中心
联系我们
帮助中心

服务时间:8:00-16:30

友情链接: 中国饲料行业信息网

(c)2007-2016 dbxmsy Inc. All Rights Reserved 黑ICP备11003350号 网安23011002000114
技术支持:鸿孚科技