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寒地养殖
Cold farming

柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-29作者:admin浏览次数:555

       真核生物都具有双层核膜包被的细胞核,从而使DNA的转录和 mRNA的翻译过程能够在相对独立的空间进行,这也是真核生物细胞区别于原核生物细胞的一个显著特征。核纤层位于核膜内侧,与内层核膜上的蛋白结合,对核膜起支持和稳定作用[1]。同时,核纤层与染色质的特定区域结合,对维持细胞核的机械性能、保持细胞核的形态结构具有重要的作用。核纤层蛋白广泛分布在核质中,参与调控 DNA的转录、复制和损伤后的修复等过程,在细胞衰老和程序性凋亡过程中发挥作用[2]。组成核纤层的蛋白主要有两类,即核纤层蛋白和核纤层蛋白相关的膜蛋白,它们是核骨架主要的组成成分[3]。核纤层蛋白又可以根据分子结构、生化特性和表达模式分为 A型核纤层蛋白和 B型核纤层蛋白。A型核纤层蛋白由 LMNA基因编码,在有丝分裂的特定组织中表达[4];B型核纤层蛋白由 LMNB1和 LMNB2基因编码,在未分化的体细胞中高表达,对细胞的成活是非常必要的[5]。核纤层蛋白编码基因的突变与人类多种遗传疾病有关,这类疾病统称为核纤层病,主要包括腓骨肌萎缩症Ⅱ型、脂肪营养不良、胰岛素抵抗型糖尿病、Werner综合征及早老症等[6]。柠檬苦素是一类高度氧化含呋喃环的四降三萜类化合物,主要存在芸香科和楝科,在叶柄花科和苦木科 植 物 体 内 也 有 少 量 分 布。柠 檬 苦 素 具 有 抗菌[7]、消炎[8]、抗疟疾[9]和抗癌症[10]等多种生物学作用。最近的研究表明,柠檬苦素类化合物还具有降低食欲和抗肥胖作用,能够明显降低机体的能量摄入,但其作用的机制还不清楚。因此,本研究分析了编码核纤层蛋白的基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的表达变化趋势,同时利用柠檬苦素干扰牛前体脂肪细胞的分化,以分析该过程是否与核纤层蛋白编码基因的表达有关。

       1 材料与方法

       1.1 主要仪器与试剂超微量核酸蛋白浓度测定仪(型号为 Nanodrop ·10· 2017(02上):10-13,17,2872000C)、CO2培养箱(型号为 3111),购自赛默飞世尔科技有限公司;倒置显微镜(型号为 CKX41),购自Olympus公司;荧光定量 PCR仪(型号为 CFXConnect),购自 Bio-Rad公司。DMEM/F12培养基、标准胎牛血清、牛胰岛素和转铁蛋白、BSA、MTT、油红 O染液和胰蛋白酶、柠檬苦素、Ⅰ型胶原酶,购自北京索莱宝科技有限公司;总RNA提取试剂盒和反转试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司。     

        1.2 牛前体脂肪细胞的分离、培养和诱导分化无菌条件下采集牛皮下脂肪组织,保存在磷酸盐缓冲液(PBS)中带回实验室。在超净台内将脂肪组织可见的血管和结缔组织去除后,用 PBS冲洗 3次,用眼科剪剪成约 1mm3 的小块,转移到无菌的带塞玻璃瓶中,加入Ⅰ型胶原酶消化液,37℃水浴振荡器中消化 60min;加入含血清的培养液终止消化,分别经 100目和 200目不锈钢筛网过滤,取滤液 700×g离心 10min;弃培养液,再次加入培养液重悬细胞沉淀后 700×g离心 5min;弃上清液后再次加入培养液重悬即得牛前体脂肪细胞悬液。将前体脂肪细胞以1×105/mL密度接种于 25cm2 的培养瓶中,置 CO2培养箱(37℃、饱和湿度、5% CO2)培养,待细胞贴壁3h后首次换培养液以除去未贴壁细胞,随后每隔2d换培养液 1次,细胞融合达到 80% ~90%时进行传代培养。选择生长状态良好的传代细胞接种于12孔培养板中,隔天更换培养液,至细胞生长至汇合程度达 70% ~80%时改用诱导分化培养液,培养2d后更换为基础分化培养液,以后每 2d更换 1次基础分化培养液,维持脂肪细胞的成熟和脂滴的聚集。药物干预和更换培养液同步进行,设置不加药物的对照组和2μmol/L柠檬苦素干预组[11]。

       1.3 油红 O染色培养细胞弃去培养液经 PBS洗 3次后,4%多聚甲醛固定 2h;PBS洗 3次,用纯化水洗 3次,1%油红O染色液染色 30min;用纯化水漂洗培养板数次,直至完全漂洗干净,将已染色的培养板置于 32℃烘箱内蒸发掉多余的水分,随即加入异丙醇萃取 15min;移出,以 100%异丙醇调零,用分光光度计以 490nm波长比色,记录吸光度值。每组内设置 3个重复。

       1.4 牛前体脂肪细胞总 RNA的提取及质量检测传代于 12孔培养板的细胞生长汇合程度为70% ~80%时记为 0天,之后分别用诱导分化培养基(对照组)和添加 2μmol/L柠檬苦素的诱导分化培养基(处理组)培养,分别收集培养 0,0.5,1,1.5,2,4,6,8,10,12天的细胞样品,用 RNAisoplus试剂盒提取 各 细 胞 样 品 总 RNA。利 用 OD260/OD280确 定RNA的纯度,通过 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,利用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定总 RNA的浓度,用 DEPC处理的双蒸水稀释至1μg/μL备用。

       1.5 候选基因的 qRT-PCR分析以提取的各细胞样品总 RNA为模板,用 PrimeScriptTM 1ststrandcDNASynthesisKit合成 cDNA第一链,以此 cDNA第一链为模板,用 SYBR PremixExTaqTMⅡ试剂盒进行荧光定量分析,总的反应体系(20μL):模 板 cDNA 第 一 链 1 μL,2×SYBRPremixExTaqTM 10μL,上、下 游 引 物 各 0.7μL,ddH2O7.6μL。反应程序:95℃ 预变性 1min;94℃ 变性 30s,退火 30s(温度见表 1),72℃延伸 30s,共42个循环。对所有样本进行 3个重复测定,并在每次试验时设阴性对照。本研究用到的荧光实时定量PCR引物序列信息见表 1。表 1 荧光实时定量分析的引物信息表Table1 TheinformationofprimersforrealtimePCRanalysis基因名称 模板序列 引物序列(5′~3′) 退火温度/℃ LMNA XM_005203621.1CGCCTGGTGGAGATTGACCGCCAGGTTGCTGTTCC57LMNB1 NM_001103295.1TGAGGACTTGGAGTTTCGGTACAGCTTGACTTGGGC51LMNB2 NM_001276353.1GGACAGGCAAGAAGGAAGCCAGATGGGAGGGCAGAAAG57GAPDH NM_001034034.1ATGCTGGTGCTGAGTATGTGGAAGTTACGGCTATCTGTCG54

       1.6 基因表达的数据分析参照参考文献[12],用 2-ΔΔCt法测定目标基因mRNA的相对表达水平,以 GAPDH基因为内标进行标准化。利用两样本 t检验分析不同处理对 LMNA、LMNB1和 LMNB2基因表达水平和细胞脂肪沉积的显著性。

      2 结果与分析

      2.1 柠檬苦素对牛前体脂肪细胞脂质沉积的影响在培养基中添加 2μmol/L柠檬苦素能够有效抑制牛前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,在第 8天时诱导分化非常明显,此时空白对照组脂肪细胞中已经出现大量的脂质液滴,而试验组只在细胞密度较高的区域出现少量的脂质液滴(见 287页彩图 1A和1B)。在诱导分化第 12天对细胞进行油红 O染色,发现对照组细胞中有密集的脂质液滴,染色后颜色较深;试验组细胞脂质沉积明显少(见 287页彩图 1C和 1D)。利用油红 O提取比色的方法测定了试验组和对照组脂肪细胞的分化情况,发现试验组脂肪细胞的分化程度极显著低于对照组(P<0.01),见图 2。

        2.2 柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中 LM ·11· №.02,2017注: 表示差异极显著(P<0.01)。图 2 柠檬苦素对细胞脂质沉积的影响Fig.2 TheeffectoflimoninonthelipiddepositionofcellsNA、LMNB1和 LMNB2基因表达水平的影响LMNA基因在牛前体脂肪细胞中具有较高的表达水平,在诱导分化的第 1天时达到最高峰,之后逐渐降低。在诱导分化的第 6天时表达水平最低(见图 3A)。在培养基中添加2μmol/L柠檬苦素后 LMNA基因的表达水平有降低的趋势,但没有达到显著程度(P>0.05)。LMNB1和 LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中具有十分相似的表达变化趋势,在诱导分化第 0.5天时表达量最高,之后逐渐降低,在诱导分化的 6~8d表达量较低(见图 3B、C)。在培养基中添加 2μmol/L柠檬苦素后 LMNB1和 LMNB2基因表达高峰出现的时间推迟到第 1天时,之后逐渐下降。值得注意的是在培养基中添加柠檬苦素后,LMNB1和 LMNB2基因在诱导分化的第0.5天时极显著低于对照组(P<0.01)。而 LMNB1基因在诱导分化的 10~12d显著高于对照组(P<0.05),说明柠檬苦素对牛前体脂肪细胞诱导分化过程中 LMNB1和 LMNB2基因的表达有一定的影响。

        3 讨论脂肪组织是动物体最主要的能量储存库,对动物的生产性能和肌肉的品质都有重要的影响。通过药物或饲料(食品)添加剂调控动物体的脂肪沉积一直是研究的热点。已发现多种化学合成的药物具有调控机体脂肪沉积的作用,在动物生产和人类临床医学上都有应用,但这类药物具有毒性和耐药性方面的缺点。柠檬苦素是一类纯天然的四降三萜类化合物,在柑橘中含量最高,是植物中重要的次生代谢产物。柠檬苦素是柑橘苦味的主要来源,在日粮中添加柠檬苦素能够降低动物的食欲,减少采食量。柠檬苦素也能够减少某些昆虫幼虫的采食量[13],干扰幼虫细胞的正常增殖和分化[14],达到降低虫害发生的效果。通过腹腔注射柠檬苦素也能够降低小鼠的食欲,达到减少采食量的目的,说明这种作用并不一定是通过改变日粮的适口性产生的。在体外培养的细胞中添加柠注:表示差异显著(P<0.05);表示差异极显著(P<0.01)。图 3 柠檬苦素对 LMNA、LMNB1和 LMNB2基因表达的影响Fig.3 TheeffectoflimoninontheexpressionlevelsofLMNA,LMNB1,andLMNB2genes檬苦素能够降低细胞增殖和分化的能力,减少细胞中脂肪的积累[11],这与本研究的结果相似。柠檬苦素能够抑制肝癌细胞的增殖,并且这种抑制作用具有明显的时间效应和剂量效应关系[15]。柠檬苦素降低细胞增殖和分化能力的机制目前还不清楚,但可能与柠檬苦素抑制细胞的胞吞作用有关[16],今后应进一步加强这方面的研究。核纤层编码蛋白基因突变能导致人类肌肉、脂肪发育异常,即所谓的核纤层病,其中埃 -德肌营养不良症(EDMD)[17]、扩张型心肌病(DCM)[18]和局部脂肪代谢障碍(FPLD)[19]与 LMNA基因突变之间的关系得到了广泛、深入的研究。LMNA基因的多个突变 ·12· 总第 519期位点与人类家族性局部脂肪萎缩有关[20],该疾病导致四肢脂肪组织从青春期开始逐渐缺失,并有面部、颈部和内脏脂肪的沉积。家族性局部脂肪萎缩在国内也有报道,该病的发生可能与 LMNA基因的 R133L突变位点有关[21]。这些研究表明 LMNA基因对机体脂肪组织的正常发育和功能维持具有重要的影响。本研究发现柠檬苦素能够有效抑制牛前体脂肪细胞的分化,降低细胞中脂质的沉积,虽然试验组与对照组 LMNA基因的表达水平没有统计学上的差异,但从图 3A可以看出试验组 LMNA基因的表达水平整体上比对照组低,造成统计学上差异不显著的原因可能是由于 LMNA基因在细胞中表达量很高,以至于柠檬苦素对其表达量的影响被掩盖了。LMNB1和LMNB2基因在细胞中的表达量较低,本研究发现柠檬苦素对这两个基因在牛前脂肪细胞特定时期的表达具有显著的影响。目前已发现核纤层蛋白能够与脂肪分化因子固醇调节元件结合蛋白(SPEBP1)相互作用,基因变异可降低其与 SPEBP1的结合力,降低SPEBP1的生物学功能,导致细胞核瓦解,从而引起脂肪组织萎缩[22]。本研究发现 LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中具有相似的表达变化趋势,均在诱导分化开始的 0.5~1d表达量升高,说明 LMNA、LMNB1和 LMNB2基因具有相同的分子调控机制。核纤层蛋白与细胞增殖的关系密切[23],牛前体脂肪细胞在诱导分化的 0.5~1d期间正经历从增殖到分化的转变;因此,必然伴随着 LMNA、LMNB1和 LMNB2基因表达量的改变。

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