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寒地养殖
Cold farming

头孢噻呋单用及联合甲氧苄啶对致病性牛源大肠杆菌防突变浓度的研究

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-02-26作者:admin浏览次数:653

       致病性大肠杆菌是牛细菌性疾病的主要病原之一,常引起新生犊牛腹泻、奶牛乳房炎和子宫炎等疾
病,给养牛业造成严重的经济损失。头孢噻呋(Ceftiofur)是第一个畜禽专用的第三代头孢菌素类抗生素,因其抗菌谱广、抗菌活性强,目前已广泛应用于肉牛、奶牛、马、猪、羊等细菌性疾病的治疗。但近年来因抗生素的大量使用和滥用,临床分离株的耐药情况日益严重。有效新药研发的相对滞后与细菌耐药的迅速发展使得人们必须合理使用现有的抗菌药物。
  防突变浓度(mutantpreventionconcentration,MPC)和耐药突变选择窗(mutantselectionwindow,MSW)的提出[1]为抗菌药物临床应用及防止耐药菌株产生提供了新的思路。该理论认为当药物浓度在MPC和最小抑菌浓度(MIC)之间,即在MSW 范围内时,存在一步耐药突变株被选择性扩增的机会。只有当药物浓度达到或高于MPC时才会抑制耐药突变体的生长,而现有药物单用多达不到MPC,盲目提高剂量势必增加毒副作用。这种情况下MPC/MSW 理论认为联合使用两种不同作用机制的抗菌药物可以降低其中一种药物的MPC,达到缩小或关闭MSW 的目的[2]。目前,国内外对头孢噻呋的药效学研究主要集中于单药的体外抗菌活性和临床应用,尚未见头孢噻呋与甲氧苄啶联合对致病性牛源大肠杆菌作用的研究报道。甲氧苄啶是防治动物疾病和复方抗菌制剂开发中常用的增效剂,能加强磺胺类药物的作用亦能加强许多其他药物的抗菌作用。试验旨在通过探讨体外头孢噻呋单用及联合甲氧苄啶对致病性牛源大肠杆菌MPC的影响,为开发头孢噻呋复方制剂及缩小牛源大肠杆菌MSW提供试验依据。
       1 材料
       1.1 菌株
  采样标本为2015—2016年黑龙江部分规模化奶牛场的犊牛腹泻粪便和临床型未治疗的乳房炎奶样,经常规分离、PCR鉴定和动物试验获得致病性牛源大肠杆菌47株;标准菌株ATCC25922,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
       1.2 培养基与药敏片
  MH肉汤、MH琼脂,购自青岛海博生物技术有限公司;头孢噻呋(EFT)、甲氧苄啶(TMP)药敏片,购自英国OXOID公司。
       1.3 抗菌药品
  甲氧苄啶(批号为T129928,纯度为99%)、头孢噻呋(批号为C129274,纯度为95%),购自上海阿拉丁生化科技有限公司。
       2 方法
       2.1 药物敏感性试验
  按照世界卫生组织推荐的K-B法,以ATCC25922为质控菌株,使用EFT和TMP的药敏纸片对47株致病性牛源大肠杆菌进行药物敏感性试验,每株菌重复3次。使用游标卡尺测量抑菌圈直径,按照参考文献[3]对药敏试验结果进行判定。
      2.2 抗菌药物储备液的配制
  按照有效成分所占比例称取头孢噻呋53.90mg,逐滴加入1mol/L的NaOH至药物溶解,用无菌双蒸水定容至10mL;称取甲氧苄啶51.20mg,用无菌双蒸水溶解并定容至10mL。两药配制浓度均为5120μg/mL,-80℃保存,用前稀释。
       2.3 MIC的测定
  采用微量肉汤稀释法[4]测定两种药物单独用药时对致病性牛源大肠杆菌的MIC,采用棋盘法测定两种药物联用时的MIC,计算部分抑菌浓度指数(FIC,FIC=A药联合时的MIC/A药单独时的MIC+B药联合时的MIC/B药单独时的MIC),判断两药的相互作用:FIC≤0.5为协同作用;0.5<FIC≤1为相加作用;1<FIC≤2为无关作用;FIC>2为颉颃作用[5]。
        2.4 MPC的测定
        2.4.1 含单药琼脂平板的配制 用倍比稀释法分别配制含EFT和TMP的MH琼脂平板,药物浓度分别为0.125,0.25,0.5,…,128,256,512μg/mL,每个浓
度4个平板。
        2.4.2 联合药物琼脂平板的制备 以EFT和TMP单药的MIC、MPC为基准,采用倍比稀释法配制含EFT+TMP的MH琼脂平板。方法如下:分别精密量取1mL不同浓度的EFT+1mL不同浓度的TMP与18mLMH培养基在90mm平皿中混匀,配制浓度为1MICEFT+1MICTMP的含药平板,以此类推配制不同浓度的EFT+不同浓度的TMP的系列含药平板,每个浓度组合配制4个平板,冷却后置于37℃温箱中除去琼脂表面的水分。
       2.4.3 菌悬液的制备 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于20mLMH肉汤中,37℃过夜培养,离心后,悬浮于200mL的MH肉汤(10倍原液)中,震荡培养6h;菌液浓度可达(6~9)×109cfu/mL,收集全部菌液,4℃、6000r/min离心10min后富集;用生理盐水将菌液浓度调整为3×1010cfu/mL,取0.1mL均匀涂布在各含药琼脂平板上,使每个药物浓度的大肠杆菌的总接种菌量约为1.2×1010 cfu,置于35℃培养箱中孵育72h,每隔24h(即24,48,72小时)做一次细菌计数,观察细菌生长情况,直至菌落数稳定。以孵育72h后仍无菌落生长的最低药物浓度为MPC。
      2.5 统计学分析
  采用SPSS20.0对试验数据进行统计分析,试验数据以“平均值±标准误”表示。
      3 结果与分析
      3.1 药物敏感性试验结果
  从47株致病性牛源大肠杆菌中选取对EFT敏感的8株大肠杆菌,药物敏感性试验结果见表1。
       3.2 EFT和TMP对致病性牛源大肠杆菌的MIC和FIC指数
  EFT和TMP单用及联用对8株致病性牛源大肠杆菌的MIC的测定结果见表2。EFT对大肠杆菌的MIC范围为0.125~4μg/mL,TMP对大肠杆菌的MIC范围为0.5 ~256 μg/mL,其中MIC≥128μg/mL的菌株在药敏试验中均对TMP表现为耐药。FIC指数介于0.25~1之间,表明EFT与TMP联用对治疗牛源大肠杆菌病具有协同或相加作用。
      3.3 EFT单用及联用对致病性牛源大肠杆菌的MPC和SI
       4 讨论
  目前基于MIC的治疗策略,仅能阻止大部分敏感细菌的生长,而使耐药突变菌株得到选择性富集扩增,即大部分抗菌药-病原菌的MSW 是开放的[6],很容易导致治疗失败和耐药体产生。虽然药物浓度高于MPC可预防耐药突变体的富集,但因临床大部分抗菌药物的MPC较高,一般为MIC的8~64倍,甚至更高,因此一般不能达到。但若以MPC浓度给药,极有可能会产生严重的毒副作用[7]。在本试验中,头孢噻呋单独用药抑制8株致病性牛源大肠杆菌一步耐药突变株产生的最低药物浓度即MPC是其MIC的64~256倍,若以此浓度大剂量给药,无疑会给动物机体造成胃肠道菌群紊乱和肾功能损害等严重副作用。
  MPC/MSW 理论认为当单药浓度不能维持在MPC以上时,可通过选择两种不同作用机制抗菌药物联用来缩小或关闭MSW,达到防止细菌耐药突变体产生同时不增加不良反应的目的,这已为部分研究所证实。L.Drago等[8]证实左氧氟沙星、环丙沙星联合阿米卡星、β-内酰胺类药物使用时可以有效控制铜绿假单胞菌耐药突变体的产生,并且得出环丙沙星在联合其他药物时耐药菌出现的机会是最少的,更推荐联合应用。国内曹琰等[9]报道:在琼脂平板试验中,阿莫西林与复方双黄连注射液联合使用可使阿莫西林单药对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MSW 缩小3倍;头孢噻呋与复方双黄连注射液联合使用可使头孢噻呋单药对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MSW缩小4倍。目前,国内外对两种药物联用缩小金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌MSW 的研究较多,对牛源大肠杆菌的报道较少。本研究中头孢噻呋主要通过作用于转肽酶来阻断黏肽(细菌细胞壁的重要组成成分)的合成,甲氧苄啶主要通过抑制二氢叶酸还原酶影响叶酸的合成,从而妨碍菌体核酸的合成。头孢噻呋联合甲氧苄啶的MPC仅为头孢噻呋单药MPC的1/8,MSW缩小了8倍,进一步验证了不同作用机制的抗菌药物联用可以缩小MSW,减少耐药突变体的产生。
  本研究还发现EFT与TMP联用后,其对临床分离的8株致病性牛源大肠杆菌的FIC指数介于
0.25~1之间,呈现协同或相加作用:EFT与TMP联用时的MIC值除2株菌未发生变化外,其余为EFT单药对照的1/4~1/2;而TMP联合EFT的MIC值为TMP单药对照的1/64~1/2。这为临床开发EFT的复方制剂提供了新思路。EFT对临床分离的致病性牛源大肠杆菌的MIC介于0.5~4μg/mL,结果比王付民等[10]的研究结果高,分析原因可能与不同地区
使用EFT的剂量和使用频率有关。
  MPC和MSW 理论为抗菌药物的耐药研究开辟了新领域,对制订新的临床用药策略,减轻广泛和
日益严重的细菌耐药问题和开发新的抗菌药物提供了新的评价指标[11]。本研究初步探讨了体外EFT单用及联合TMP对致病性牛源大肠杆防突变浓度的影响,而体内药物浓度处于动态变化中,受到的影响因素也较多,因此联合用药需结合PK-PD模型在体内试验中进行进一步的研究。
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