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寒地养殖
Cold farming

绵羊OAS1基因PCR的优化条件

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2017-12-25作者:admin浏览次数:124

                                     王苏瑶,张英杰,刘月琴,史秀芬,张雅飞

                        (河北农业大学 动物科技学院,河北 保定 071000)

       OAS基因是一类重要的干扰素刺激基因,在干扰素诱导下表达,发挥免疫作用。1974年,I.M.Kerr等[1]在干扰素处理的人体细胞中初次发现 OAS基因。OAS基因具有丰富的多态性。J.Chebath等[2]、A.G.Hovanessian等[3]在干扰素处理后的人体细胞中共发现了 3种形式的 OAS,即 OAS1、OAS2、OAS3,具有降解病毒 mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡的作用,在先天性抗病毒免疫中发挥重要作用[4-5]。近年来研究发现,干扰素刺激基因与胚胎的附植和早期妊娠诊断有关。J.C.Green等[6]研究表明,人工授精(AI)18d的妊娠青年母牛比空怀母牛 OAS1基因表达量高,并且 OAS1基因表达量以与 0d时的比值大于 1.4为临界点,诊断的敏感度为 100%。因此,研究 OAS1基因对母羊妊娠、空怀,及时进行早期妊娠诊断等,为后续基因表达的研究奠定基础。通过对 OAS1基因片段的 PCR扩增条件优化,得出 OAS1基因片段的最佳 PCR反应体系。

        1 材料

        1.1 试验动物以衡水志豪科技有限公司的小尾寒羊为研究对象,采集小尾寒羊外周血液 5mL,其中 3mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)-K2 静脉采血管抗凝,2h内冷藏运输至实验室。使用红细胞裂解液分离出外周血液白细胞。

       1.2 试验试剂TransZolUp,北京全式金生物技术有限公司生产;异丙醇(Isopropanrol),天津福晨化学试剂厂生产;氯仿(Chloroform)、无水乙醇(Ethanol),天津天力化学试剂厂生产;PrimeScript RTreagentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime)反转录试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司生产;红细胞裂解液、100bpDNALadder、2×EsTaqMasterMix,康为世纪生物科技有限公司生产。

        2 方法

        2.1 绵羊白细胞中总 RNA的提取经细胞裂解、蛋白质抽提与变性析出、RNA的沉降,最后提取出 3管 RNA,置于冰上进行后续试验,或放于 -80℃冰箱,备用。用核酸蛋白分析仪检测提取的总 RNA浓度和 OD260/OD280值,OD260/OD280值一般在 1.9~2.1之间,并使用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的纯度和完整性,以进行后续反应。

       2.2 模板 cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书进行反转录操作。

       2.3 引物的设计与合成根据 GenBank提供的 OAS1基因序列设计试验引物,利用 PrimerPremier5软件设计绵羊 OAS1引物,引物序列见表 1。

        2.4 PCR目的片段的扩增以 cDNA为模板进行 PCR扩增反应,测试的反应条件为:94℃预变性 5min;94℃变性 30s,60℃ 退火 30s,72℃延伸 30s,共 32个循环;72℃再延伸10min。PCR扩增反应的总体积为 20μL,其他参数固定不变,将影响 PCR扩增效果的几个重要条件及参数进行优化,筛选出最佳反应体系。PCR扩增反应的总体积(20μL):EsTaqMasterMix10μL,上、下游引物量分别设置为 0.5μL、1μL,模板 cDNA分别设置为 1μL、2μL,退火温度分别设置为 59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃。测定后根据结果可确定 OAS1基因最佳 PCR反应条件。

       3 结果与分析

       3.1 RNA的质量试验共提取了 3组 RNA。第 1组 RNA的浓度为454.0ng/μL,OD260/OD280值为 1.91;第 2组 RNA的浓度为 572.1ng/μL,OD260/OD280值为 1.94;第 3组RNA的浓度为 397.6ng/μL,OD260/OD280值为 1.88。1%琼脂糖凝胶电泳成像系统拍照显示,这 3组的28S条带最亮,18S条带次之,5S条带最暗,说明提取的总 RNA完整性较好,可进行后续反应。总 RNA琼脂糖凝胶电泳结果见图 1。

        3.2 引物检测引物检测的反应条件为:94℃预变性 5min;94℃变性 30s,60℃退火 30s,72℃延伸 30s,共32个循环;72℃再延伸 10min。1%琼脂糖凝胶电泳结果表明,OAS1引物的凝胶成像条带清晰、明亮,无杂带,证明设计引物可用,OAS1引物的 PCR扩增效果见图 2。将 OAS1基因 PCR产物进行测序,测序结果符合预期片段,且匹配度一致,测序结果见 293页彩图 3。

         3.3 最佳模板浓度模板 cDNA体积分别为 1μL、2μL的 1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,2μL模板 cDNA的 PCR产物条带较为清晰、明亮,无杂带,1μL模板 cDNA的 PCR产物条带相对较暗,说明 2μL模板 cDNA为最佳模板。不同模板体积的 PCR扩增结果见图 4。

       3.4 最佳引物量引物量分别为 0.5μL、1μL的 1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,1μL引物的 PCR产物条带更为清晰、明亮,无杂带,1μL引物的 PCR产物条带相对较暗,说明 1μL引物为最佳引物量。不同引物量的 PCR扩增结果见图 5。

       3.5 最佳退火温度退火温度分别为 59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃的 1%琼脂糖凝胶电泳成像结果显示,

        4 讨论在 PCR的反应程序中,一般情况下预变性、变性、延伸的温度很少改变,改变最多的通常是退火温度。退火温度过高或过低对 PCR的扩增效果均会产生较大影响。退火温度过高特异性较强,但不能产生目的条带;退火温度过低特异性较差,杂带增多,因此找到合适的退火温度是 PCR是否成功的关键[7]。众所周知,设计引物是影响 PCR扩增试验的重要因素之一[8]。好的引物不仅能够避免杂带与非特异性产物的产生,同时还能识别基因组模板和模板cDNA[9]。本次 PCR扩增试验表明,OAS1引物的凝胶成像结果良好,并且通过 PCR产物测序进一步验证了其引物的适配性。模板 cDNA是 PCR扩增反应中必不可少的,模板的量及纯度也影响 PCR的结果,是 PCR反应取得良好结果的重要保障[10]。试验在模板浓度相同的基础上判断模板量的大小对 PCR扩增效果的影响。试验结果表明,在模板 cDNA的量为 2μL的情况下,PCR扩增的条带最清晰、明亮。因此,模板的量过多或过少均会影响 PCR扩增反应,模板的量过少则会导致 PCR条带偏暗,模板量过多则会出现明显的拖尾现象并伴有杂带。试验过程中发现,OAS1基因在 PCR产物扩增过程中会出现条带不清晰、大小不清楚、杂带增多、100bpDNALadder无条带的现象,原因可能是引物污染、模板 cDNA去基因组不干净,或退火温度不合适及 TBE缓冲液放置时间过长出现大量沉淀等。

       5 结论绵羊外周血液白细胞 OAS1基因 PCR扩增最佳条件(20μL)为:退火温度 60℃,循环次数为 32次,Mix为10μL,灭菌 ddH2O7μL,模板 cDNA2μL,上、下游引物 1μL。

 

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