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寒地养殖
Cold farming

绵羊FAM134B基因组织表达规律及其与肌内脂肪含量的关系

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-30作者:admin浏览次数:922

       近年来,因肥羔肉瘦肉率高、口感鲜嫩、营养价值高、胆固醇含量低等特点使得市场需求量不断上
升[1]。敖汉细毛羊因其适应性强、抓膘快、繁殖率高等优点比较适合肥羔生产,增加肥羔肉产量,以更好地适应市场需求量。肌内脂肪(intramuscularfat,IMF)的沉积量在一定程度上决定了口感品质[2],若能在稳定瘦肉比例的基础上适当提高IMF含量,可以有效改善羊肉口感品质,此领域的研究具有较大的实际意义。FAM134B基因mRNA表达量和蛋白水平随结肠癌、直肠癌的发展而变化,此基因有助于调控结肠癌、直肠癌从早期到晚期发展的某些过程[3]。FAM134B基因的变异会引起严重的感觉神经病变[4-5]。FAM134B基因功能性缺失突变能影响高尔
基体对蛋白质和脂质的分配及修饰等重要功能[6],这提示FAM134B基因极有可能是与脂肪沉积相关。朱武政等[7]研究表明,猪FAM134B基因的表达有可能正向调控IMF沉积。山羊FAM134B基因在背最长肌、腿肌的表达量与其IMF含量的相关性显著[8]。目前,FAM134B基因对家畜肉质方面的影响,仅在猪和山羊上有研究,而对于绵羊的这方面研究还未见报道。本研究通过实时荧光定量PCR方法对绵羊不同器官组织中的FAM134B基因表达情况进行探讨,并对该基因在2个部位肌肉组织中的mRNA表达量与其各自IMF含量是否存在关联性进行分析,为寻找与绵羊肉品质相关候选基因提供参考数据。
      1 材料
      1.1 试验动物
       试验羊来自青岛奥特种羊场在相同饲养条件下的12月龄毛肉兼用型敖汉细毛羊5只,屠宰后迅速
采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌、腹部脂肪、皮下脂肪器官组织样品,立即将组织样品置于液氮中,然后于-80℃冰箱保存,用于提取总RNA。另取背最长肌、股二头肌样各150g,于-20℃保存,用于IMF含量测定。
      1.2 主要试剂
      TripureRNA IsolationReagent、TranscriptorFirst
StrandcDNA SynthesisKit、LightCycler 480 SYBRGreenⅠ Master,均由Roche公司生产;琼脂糖,Thermoscientific公司生产;DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×),天根生化科技(北京)有限公司生产。
      2 方法
      2.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成取每个组织样各50mg并加入液氮充分研磨,采
用TRIzol法提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌、腹部脂肪、皮下脂肪器官组织的总RNA,采用EffendorfBiophotometerPlus分光光度计测量RNA浓度并通过电泳检测其完整性。反转录总RNA用量为1μg,按照TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒上的说明书进行操作,合成的cDNA于-20℃ 保存。
      2.2 引物设计
      参考GenBank上绵羊FAM134B基因序列(登录号为XM_004017080.1),采用PrimerPremier5.0设计1对FAM134B特异性引物,将3-磷酸甘油醛脱
氢酶(glyceraldehyde3- phosphatedehydrogenase,GAPDH)作为内参基因,用同样的方式设计引物,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列。   

      2.3 FAM134B基因在绵羊不同器官组织中的表达量测定
       采用LightCycler 480SYBRGreenⅠ Master实时荧光定量PCR仪进行定量分析。每个待测样本设置3个重复,以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算分析。

      2.4 IMF含量的测定
       采用索氏抽提法测定背最长肌、股二头肌中的IMF含量,每个样品重复测量3次,按照公式:IMF含量(%)=(x-y)/a×100%,计算IMF含量。式中:x为浸提前含烘干样品滤纸包重,y为浸提后含烘干样品滤纸包重,a为烘干样品重。
       2.5 数据的统计分析
        荧光定量的数据采用2-ΔΔCt法进行相对表达处理,构建单因素试验线性模型:yij=μ+αi+εij。式中:yij表示mRNA的表达量,μ表示总体平均数,αi表示组织效应,εij表示试验误差。用统计学软件SPSS17.0对试验结果进行单因素方差分析,采用Duncan’s法对各组织间mRNA表达的主效应进行多重比较,采用Pearson分析方法对FAM134B基因表达量与IMF含量进行相关分析。
        3 结果与分析
        3.1 总RNA的提取与检测
        提取组织总RNA后,经EffendorfBiophotometerPlus分光光度计检测,OD260/OD280值在1.8~2.0之间,并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。M.DL-2000Marker;1,2.总RNA。RNA电泳出现3条带,28S、18SRNA均较明亮,且2条带的比值接近2∶1,表明所提取的总RNA完整性较好,浓度和纯度符合后续试验要求。
       3.2 FAM134B基因普通PCR扩增结果分析
     绵羊GAPDH基因(A)和FAM134B基因(B)的扩增产物引物扩增目的条带单一,大小与设计的一致,说明引物可用;FAM134B基因在所选器官组织中均有表达,可以进行荧光定量试验。
      3.3 FAM134B基因各器官组织表达结果与分析
      采用实时荧光定量PCR对绵羊不同器官组织中的FAM134B基因mRNA表达情况进行检测分析以肾脏为参照,FAM134B基因在绵羊的内脏、肌肉、脂肪器官组织中均有表达,其中在肝
脏中的表达量最高,而在肺脏中的表达量最低。在背最长肌和股二头肌之间的表达量差异极显著(P<
0.01);在内脏器官中,除脾脏和肺脏间差异不显著(P>0.05)外,其他各器官间差异均极显著(P<0.01);在脂肪组织中,皮下脂肪的表达量极显著高于腹部脂肪的表达量(P<0.01);除股二头肌和脾脏、肺脏之间,背最长肌和腹部脂肪之间差异不显著(P>0.05)外,任意2个部位之间的表达差异均极显著(P<0.01)。
       3.4 IMF含量测定及其与FAM134BmRNA表达的相关分析,背最长肌与股二头肌中的IMF含量差异极显著(P<0.01),背最长肌与股二头肌中的FAM134B基因表达量与其各自的IMF含量均呈极显著正相关(P<0.01)。
      4 讨论
      I.Kurth等[6]研究表明,FAM134B基因的突变会导致高尔基体结构的改变,进而影响脂质的修饰和运输。通过对猪FAM134B基因表达进行抑制发现,FAM134B基因的表达对脂肪细胞分化合成代谢基因的表达有一定的促进作用,对脂肪分解代谢基因表达产生了一定的抑制作用,由此对FAM134B基因的调控方式有了一定的认知[9]。山羊背最长肌、腿肌的FAM134B基因表达与其IMF含量存在显著的关联性[7],由此推断出,FAM134B基因有可能正向调控山羊IMF沉积。mRNA水平的表达分析是研究不同组织中分子调控机制要充分考虑的一个方面[8],为基因功能的验证提供选择依据。肌肉组织作为IMF沉积最主要的组织[10],选取了背最长肌和股二头肌两块典型的肌肉组织作为试验材料,以期试验结果准确、可靠。试验采用荧光定量PCR方法发现,FAM134B基因在所选内脏、背最长肌、股二头肌、腹部脂肪、皮下脂肪组织内均有不同程度表达,除股二头肌和脾脏、肺脏之间,背最长肌和腹部脂肪之间差异不显著外(P>0.05),任意2个部位之间均达到极显著水平(P<0.01),表明FAM134B基因的转录具有一定的组织特异性。FAM134B基因在山羊肝脏中的表达量最多[7],而肝脏是合成脂质的主要场所[11],由此推测,该基因也可能参与山羊脂肪细胞的分化与代谢的调控[12];结合此基因具有物种间的保守性,可以推测,该基因可能同样调控绵羊的脂质代谢。研究表明,绵羊FAM134B基因在肝脏中表达量最多,说明该基因有可能对绵羊的脂质代谢有一定的调控作用。本试验结果表明,FAM134B基因在绵羊背最长肌和股二头肌之间的表达差异极显著(P<0.01),背最长肌和股二头肌的IMF含量差异极显著(P<0.01),通过相关分析这2个部位的表达量与IMF含量均表现出极显著正相关,相关系数分别为0.982,0.997,这种相关性表明,FAM134B基因的表达对IMF的沉积可能存在一定的促进作用,这一结果与前人在其他物种上的研究结果基本一致。目前,对于绵羊FAM134B基因是否会对IMF沉积产生影响及其调控机制仍处在基础研究状态,下一步可以考虑研究该基因在肌肉组织中mRNA表达的发育变化规律并分析其表达是否对IMF的沉积产生影响,同时也可以通过细胞验证FAM134B基因的调控机制以及FAM134B基因是如何调控IMF含量变化的。
      5 结论
      研究表明,FAM134B基因在绵羊内脏、背最长肌、股二头肌、腹部脂肪、皮下脂肪等器官组织中均有不同程度表达,背最长肌、股二头肌的表达量差异极显著(P<0.01),并与其各自的IMF含量具有极显著的正相关(P<0.01),相关系数分别为0.982,0.997。初步证明了FAM134B基因可以作为影响绵羊育肥性状的重要分子遗传标记,为进一步验证FAM134B基因的功能和调控脂质代谢通路提供了前提依据。

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