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寒地养殖
Cold farming

不同年龄山羊胃肠道乳酸菌的分离鉴定

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-30作者:admin浏览次数:1019

      乳酸菌(Lacticacidbacteria)是一类能发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称。自然界中,从植物、水、土壤、发酵食品到动物胃肠道均可分离到乳酸菌[1]。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上有43个属,包括373个种和亚种,其中常见的属有乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、明串珠菌属、片球菌属等[2-3]。作为一种重要的益生菌,乳酸菌具有改善肠道内环境、调节肠道微生物菌群、建立肠道有益微生物区系和抑制致病性微生物的作用[4-6]。新生动物消化道发育不够完善,容易受到各种病原微生物的侵袭,但通过摄入乳酸菌等益生菌定植于胃肠道后,可竞争性抑制其他病原微生物在肠道黏膜上皮的定殖和生长[7]。随着山羊养殖向规模化、集约化方向发展,羔羊腹泻已成为严重危害山羊健康的重要传染性疾病,由此带来了巨大经济损失。动物益生菌制剂是预防和治疗胃肠道疾病,特别是细菌性腹泻最安全有效的一种微生物制剂,在细菌性腹泻防治中发挥着重要作用。为进一步了解山羊胃肠道生理机能,选择合适的乳酸菌用于山羊微生态制剂,试验测定了不同年龄山羊瘤胃黏膜和回肠黏膜刮取物中的乳酸菌种类,现报道如下。
      1 材料与方法
      1.1 样品的采集
      2月龄断奶羔羊、8月龄和2岁健康简州大耳山羊各3只,购自四川省简阳市贾家镇简阳大哥大牧业
有限公司简州大耳山羊种羊场。山羊放血致死后,取出胃肠道,无菌操作刮取约1g瘤胃和回肠黏膜,分
别置于含5mLMRS液体培养基的试管中,供乳酸菌分离用。
     1.2 培养基及试剂
     MRS肉汤,购自Solarbio公司;EX-TaqDNA聚合酶、PCR试剂、DL-2000Marker、dNTP,购自TaKaRa公司;琼脂糖,购自Oxoid公司。
    1.3 细菌的分离与纯化
     将含约1g瘤胃黏膜或回肠黏膜的5mLMRS液体培养基充分振荡、混匀,进行10倍系列稀释,取原混合液、10,100倍稀释液各0.1mL,均匀涂布于含有2.5% CaCO3 的MRS固体平板上,置于37℃、5%CO2条件下恒温培养48~72h,观察记录菌落特征;挑取具有溶钙圈、形态较小的单菌落进行革兰染色,镜检。选取革兰染色呈阳性的无芽孢杆菌和球菌作为可疑乳酸菌,进一步接种于MRS固体培养基上纯化培养,并保存。
      1.4 分离菌株16SrRNA序列扩增和测序分析将纯化的菌落接种于MRS液体培养基中,置于37℃振荡培养24h,取培养液,采用微波炉加热法[8]提取细菌基因组DNA作为模板。16SrRNA序列扩增引物采用革兰阳性菌的16SrRNA通用引物,引物序列: 16S F1, 5′ - CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATGGCTCAG -3′;16S R1,5′-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增目的片段为1500bp左右,扩增体系为25μL:10×Buffer2.5μL、dNTP2μL,上下游引物各1μL,模板2μL,Taq酶0.2μL,加ddH2O16.3μL,并设阴性和阳性对照。PCR反应条件:95℃预变性5min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸1.5min,共35个循环;72℃延伸10min,16℃暂存结束反应。上述PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小,将特异性条带的PCR产物送上海生工生物工程有限责任公司进行测序。
      2 结果与分析
      2.1 分离细菌的革兰染色镜检结果
      从9只山羊的9份瘤胃黏膜样品和9份回肠黏膜样品中共分离到40株革兰染色阳性的疑似乳酸菌,形态基本为球形和杆状、散在或短链状排列,无芽2.2 16SrRNA序列扩增结果对分离纯化的疑似乳酸菌进行PCR扩增,电泳检测结果见图2,其条带位置与预期片段大小相符。2.3 16SrRNA序列测定结果对分离纯化出的40株疑似乳酸菌进行序列测定,共鉴定出26株乳酸菌,归属于5个属9个种。这5个属分别为链球菌属、明串珠菌属、片球菌属、乳杆菌属、肠球菌属,9种乳酸菌分别为巴黎链球菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌、弯曲乳杆菌、耐久肠球菌、海氏肠球菌、鹑鸡肠球菌、屎肠球菌和粪肠球菌。
      2.4 不同年龄段山羊乳酸菌分离结果
      从2月龄山羊瘤胃刮取物中分离到巴黎链球菌,回肠黏膜刮取物中分离到屎肠球菌;8月龄山羊瘤胃
刮取物中分离到巴黎链球菌、耐久肠球菌和弯曲乳杆菌,回肠黏膜刮取物种分离到屎肠球菌和肠膜明串珠
菌;从2岁山羊瘤胃刮取物中分离到巴黎链球菌、耐久肠球菌、戊糖片球菌、海氏肠球菌、鹑鸡肠球菌,回肠黏膜刮取物中分离到屎肠球菌、肠膜明串珠菌和粪肠球菌。
      3 讨论
      三个年龄段山羊瘤胃黏膜和回肠黏膜中乳酸菌分离鉴定结果揭示了乳酸菌在不同年龄段山羊中分布的差异,从幼龄山羊到成年山羊,随着山羊年龄的增加,分离到的乳酸菌种类逐渐增多,定植于2月龄山羊羔的巴黎链球菌、屎肠球菌和定植于8月龄幼龄山羊的耐久肠球菌、肠膜明串珠菌均能在2岁成年山羊中分离得到,提示可从特异性存在于较大年龄山羊中的乳酸菌中筛选出可作为益生菌的菌株,用于研究和开发山羊微生态制剂供羔羊尽早使用,以期尽早建立幼龄山羊胃肠道中的丰富的微生物菌群。利用益生菌可帮助羔羊尽早建立丰富的肠道微生物区系,增强抵御病原微生物的能力,从而减少消化道疾病的发生,促进幼畜生长。李秀萍等[9]发现,应用微生态制剂治疗羔羊腹泻的效果明显优于抗生素。许光胜等[10]研究发现,粪肠球菌不仅对常见的病原微生物具有较强的颉颃能力,而且饲料中添加粪肠球菌能够降低仔猪腹泻,改善仔猪生产性能。任丽等[11]报道,弯曲乳杆菌对李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和假单胞菌具有明显的抑制作用。骆超超等[12]发现,饲料中添加肠膜明串珠菌对提高奶牛产奶量、改善乳成分指标方面具有显著作用。且肠膜明串珠菌除具有普通乳酸菌的高产酸能力、抗氧化能力和颉颃致病菌的特性外,还具有在发酵中产生种类丰富、数量较多胞外多糖的能力[13-14]。王浩等[15]报道,在AA肉鸡生长全期,每日每只鸡饲喂1×1010cfu戊糖片球菌,可降低料重比、提高胸肌率,同时降低血清胆固醇含量。根据我国农业部规定的可以直接饲喂动物的微生物目录,试验分离鉴定的粪肠球菌、屎肠球菌和戊糖片球菌等可作为益生菌的候选菌株。另外,美国食品药物监督管理局(FDA)和美国饲料工业协会(AAFCO)公布的可直接饲喂的微生物[16]中,还包括本试验分离鉴定的弯曲乳杆菌和肠膜明串珠菌。本试验中,通过对不同年龄段山羊瘤胃黏膜和回肠黏膜中乳酸菌的分离、鉴定、比较,不仅阐明了不同年龄山羊胃肠道乳酸菌种类的差异,而且为研究和开发山羊微生态制剂提供了候选菌株。
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