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寒地养殖
Cold farming

大鲵生物活性肽和酶解产物研究及应用进展

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-30作者:admin浏览次数:777

       中国大鲵(Andriasdavidianus)是我国珍稀名贵特产,属国家二类保护动物,已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅰ中。大鲵是一种传统名贵药用动物,具滋阴补肾、补血行气的功效,也是一种食用价值极高的经济动物,被誉为“水中人参”[1]。为保护和利用大鲵资源,20世纪60年代以来大鲵的人工养殖取得重要进展。尤其是以陕西汉中为代表的多个地区充分利用生态环境资源,大力开展苗种生态繁殖。随着原生态、仿生态和全人工三大繁育模式技术的突破,全国大鲵繁殖与养殖总量约为170万尾[2]。而资源量的增加使大鲵产品的开发利用成为可能。养殖大鲵具有极大的市场前景和产业化开发价值,目前已被开发为食品、保健食品、药品及护肤品等多样化产品[3-4]。
   生物活性肽是一类分子质量小于6000u、分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的分子聚合物,生物活性肽具有抗氧化、免疫调节、抗高血压、抑菌、抗癌等显著生理功能,被誉为“21世纪人类健康新宠儿”[5]。
  生物活性肽一般可由直接提取法、人工合成法蛋白质降解法制备。其中酶法水解蛋白可定位水解产生特定肽,条件温和,水解过程易于控制,且所生产的活性肽产品具有良好的溶解性、耐酸耐热稳定性、安全性高、无不良反应等优点而被较广泛应用[6]。本文综述了中国养殖大鲵生物活性肽和酶解产物的
制备、结构特性、生物学活性及应用等方面研究进展,并分析大鲵活性肽的开发利用现状,探讨后期开发方向,旨在为大鲵的特色产品开发和资源有效利用提供理论指导和借鉴。
      1 大鲵酶解产物的制备及工艺
  目前研究主要以大鲵黏液、大鲵肉、大鲵皮及大鲵皮肤分泌液为原料,通过酶解技术制备大鲵生物活
性肽及酶解产物,并通过单因素、正交试验及响应面法确立其最佳工艺。
     1.1 大鲵黏液低聚糖肽
  曲敏[7]采用海洋曲霉菌酸性蛋白酶,通过正交试验确立大鲵体表黏液酶解最优工艺条件为E/S
0.03%,温度55℃,酶解时间3h,pH值2.0;并将酶解液在冷冻干燥前进行-8.6~-13.6℃预冻结,提高了大鲵酶解液的浓度。李伟等[8]采用复合蛋白酶(胰蛋白酶和海洋碱性蛋白酶按活力单位比为3∶7比例混合)对大鲵黏液进行酶解,最佳工艺条件为复合酶添加量0.5%(质量比),酶解时间2h,底物浓度0.1mg/mL,温度65℃,pH值8.0。时间飞行质谱研究表明,酶解产物分子质量小于4000u。李伟等[9]将大鲵黏液在0~10℃匀浆,向匀浆中加入1~3倍体积、pH值7~8、0.01~0.1mol/L磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1% ~1.0%的复合酶(海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3∶3∶2∶2比例混合)酶解12~48h,离心上清液,采用截留分子质量4000u以下的超滤膜分离器分离,SephadexLH-20分子筛层析柱分离,通过大孔吸附树脂及活性炭后冷冻干燥,制得大鲵黏液低聚糖
肽(GSGPs)。
      1.2 大鲵肉活性肽
  曹娟娟[10]通过单因素和正交试验确立了大鲵肌肉的最佳酶解条件为:料液比1∶4,酶解时间5h,酶用量1500U/g。鲍九枝等[11]通过响应面法确立大鲵肉活性肽提取最佳工艺条件:超声时间19.0min,超声功率249.9W,液料比22.5∶1,酶用量3.3%。王文莉等[12]利用Aspergillussp.酸性蛋白酶对大鲵肉进行酶解,其最佳工艺条件为:酶用量0.4%(质量比),底物浓度0.1g/mL,酶解时间5.5h,温度45℃,pH值2.0。付静等[13]采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme、Protamex、Alcalase5种酶,在各酶最适pH值和温度下,按照加酶量2000U/g、料液比1∶25对大鲵肌肉粉酶解5h,其中Protamex酶解产物的肽得率最高;并通过正交试验确立大鲵肌肉粉Protamex酶解的最佳工艺条件为:酶解时间7h,温度50℃,料液比1∶35。徐阳等[14]研究了不同蛋白酶及其不同组合、酶解时间、酶添加量、料液比、温度和初始pH值对大鲵肌肉酶解的影响,结果表明,最佳酶解组合为中性蛋白酶和风味蛋白酶,最佳酶解工艺为风味蛋白酶和中性蛋白酶添加量均为6000U/g、酶解温度55℃、酶解时间3h、料液比1∶8、初始pH值6.86,优化条件下多肽得率为90.28%。阳爱生等[15]公开了动物水解蛋白酶和中性蛋白酶酶解大鲵蛋白获得GSGPs的方法,包括预处理、酶解、纯化、酶灭活、脱苦、脱色、无菌处理、浓缩及冷冻干燥等步骤。该方法水解条件温和,可定位水解产生特定多肽,水解过程易于控制,所得产物具有易消化、易吸收,且安全性高,生产过程营养元素损失少,对环境友好等优点。
      1.3 大鲵皮胶原蛋白肽
  叶欣等[16]通过对6种蛋白酶进行筛选,优选出中性蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶作为制备大鲵皮小分子胶原蛋白肽的三种最佳用酶,并确定其添加量分别为中性蛋白酶3000 U/g、风味蛋白酶600U/g、木瓜蛋白酶8000U/g,确定最佳工艺参数为料液比1∶4、酶解温度55℃、酶解时间7h。
      1.4 大鲵皮肤分泌液抗菌肽
  王利锋等[17]通过5%醋酸浸提及SephadexG-50、G-25凝胶过滤色谱等方法首次从大鲵皮肤分泌液中分离纯化得到一种抗菌肽,Tricine-SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳检测显示,该小分子多肽相对分子质量约为4300,具有较强的碱性,可能是具有较强阳离子特征的碱性肽。
      2 大鲵肽生物活性研究
      2.1 肝损伤保护作用
  李林格等[18]研究表明,大鲵皮胶原蛋白肽对乙醇诱导的肝脏损伤小鼠具有保护作用[低50mg/(kg·d)、高150mg/(kg· d)剂量]。曲敏等[19]研究表明,GSGPs具有保护CCl4诱导的急性肝脏损伤的作用[中400 mg/(kg· d)、高800mg/(kg·d)剂量组]。以上两种大鲵活性肽均可显著抑制小鼠肝脏组织中由乙醇或CCl4造成的血清中AST、ALT活性的升高,明显降低肝脏组织MDA含量,并提高肝脏组织中SOD活性。病理结果表明,对照组肝细胞均明显肿胀变形,肝细胞索紊乱,且伴有炎症细胞侵润。而GSGPs或大鲵皮胶原蛋白肽不同剂量治疗组肝细胞排列规则,肝细胞索排列整齐,肝组织损伤较对照组明显减轻。
      2.2 对小鼠免疫功能调节作用
  曲敏等[20]研究表明,GSGPs能够有效提高小鼠的免疫功能。试验数据显示,与对照组相比,GSGPs的低、中、高不同剂量组小鼠血清中IgG含量和吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数均明显增加,T淋巴细胞活性均显著提高。
      2.3 抗疲劳活性
  李伟等[8]给小鼠灌胃15dGSGPs后进行小鼠负重游泳试验,结果显示,GSGPs使小鼠游泳力竭时间达103min,肝糖原消耗量与空白对照组相比减少65.0%,肌肉中乳酸量与空白对照组相比减少24.4%,表明GSGPs具有显著抗疲劳作用;曲敏[7]将GSGPs按照低浓度(100 mg/kg)和高浓度(150mg/kg)两种剂量连续饲喂小鼠15d后进行小鼠负重游泳试验,结果显示,GSGPs高浓度组小鼠的游泳力竭时间达78.5min。与空白组相比,服用高浓
度GSGPs小鼠肝糖原浓度增加30.3%,尿素减少68.4%,肌乳酸浓度减少39.2%。
      2.4 抗氧化活性
  曲敏[7]研究表明,GSGPs具有较好的抗氧化活性,且活性随着浓度的升高逐渐增强。当GSGPs浓度为1mg/mL时,DPPH 自由基的清除率高达92.25%,羟基自由基的清除率达54.69%,超氧阴离子自由基的清除率达52.00%。金桥等[21]测定了大鲵糖肽的羟基自由基清除能力,结果表明,大鲵糖肽浓度为5.78μg/mL时,羟基自由基的清除率达60.19%,具有较好的抗氧化活性。曹娟娟[10]研究表明,大鲵肌肉酶解物抗氧化活性和抗氧化稳定性均强于其他4种酶解物(牛、猪、鸡和鱼肌肉酶解物),且溶解度、吸水能力、吸油能力、EAI和ESI均较好。王睿等[22]研究表明,GSGPs的羟基自由基清除率达50.85%。
      2.5 抑制ACE活性
  曲敏[7]研究表明,GSGPs具有较好的ACE抑制活性。HPLC测试表明,GSGPs浓度为40mg/mL时对ACE抑制活性高达90.82%。
     2.6 抗紫外线性能
  曲敏[7]研究表明,GSGPs对波长为280~315nm的紫外线有一定吸收,且紫外损伤试验表明,小鼠耳部皮肤涂抹GSGPs可以避免紫外照射损伤。王睿等[22]制备的GSGPs润肤霜对波长为260~315nm的紫外线显示较强吸收能力,与GSGPs自身的紫外吸收波长相比发生了一定程度的蓝移。
      2.7 抗皮肤光老化
  赵小忠等[23]研究了GSGPs抗皮肤光老化的临床疗效,对40名面部出现光老化的女性受试者应用导入仪,导入GSGPs复合粉5~10min,即刻外敷仙鲵活性膜,连续治疗8次,每次间隔3d,医生和受试者对研究前后受试者的面部皮肤变化进行主观评价,再应用VISIA皮肤图像分析系统对受试者皮肤变化进行分析。结果显示,GSGPs具有减轻面部色斑、改善皱纹、缓解紫外线对皮肤的影响,具有修复皮肤,延缓皮肤衰老的作用。
      2.8 抑菌作用
  王利锋等[17]首次从大鲵皮肤分泌液中分离纯化得到一种抗菌肽,研究表明,此抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均具有较强的抗菌活性,此抗菌肽还对铜绿假单胞菌具有较强的抗菌活性,并对铜绿假单胞菌感染的ICR(instituteofcancerresearch)小鼠创面显示较强抗感染作用,能够明显降低其死亡率[24]。
  陈丽萍等[25]研究了GSGPs的体外抑菌活性,结果表明,大鲵黏液及其酶解产物无显著抑菌作用。陈德经等[26]研究表明,大鲵皮肤对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌率分别为157.1%、90.7%和78.1%,但对大肠杆菌无抑制作用。而大鲵皮肤黏液、大鲵肉、大鲵油均对以上四种菌无显著抑制作用,进一步说明大鲵皮肤为主要抑菌部位。因此,大鲵皮肤酶解产物的抑菌活性有待进一步研究。
      2.9 抗血小板聚集活性
  陈丽萍等[25]采用全血电阻法血小板聚集试验研究了GSGPs的抗血小板聚集生物活性,结果表明,胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶三种酶酶解产物均对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集有抑制作用,其聚集度分别为(4.73±2.20)Ω、(6.80±0.98)Ω、(6.13±0.76)Ω,抑制率分别为48.98%、26.65%、33.87%。其中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶大
鲵黏液酶解产物具有显著抗血小板聚集作用。
      3 结构特性
      3.1 分子质量、氨基酸组成、糖组成、糖肽连接方式
  李林格等[18]通过胃蛋白酶水解大鲵皮制备胶原蛋白,并经木瓜蛋白酶水解制备大鲵皮胶原蛋白肽。经SDS-PAGE检测,其分子质量低于5500u;经紫外光谱(UV)及红外光谱(IR)测定,其具有胶原蛋白的三股螺旋结构。
  曲敏[7]和冯叙桥等[27]经飞行质谱检测,确认大鲵黏液酶解物为分子质量低于3500u的GSGPs;并通过化学方法初步研究了GSGPs的糖组成、氨基酸组成及糖肽连接方式,结果GSGPs总蛋白含量为80.01%,总糖含量为15.65%。总糖中盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、唾液酸分别占GSGPs的3.39%、2.45%、0.65%和0.60%,占总糖含量
的22.38%、16.17%、4.29%和3.69%。有关GSGPs的氨基酸组成,曲敏[7]研究表明,GSGPs中含有18种氨基酸,其中苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的含量分别达13.1%、11.2%和12.5%,而丝氨酸含量仅为0.2%。冯叙桥等[27]研究表明,在GSGPs氨基酸组成中,苏氨酸的含量最高,达13.1%,其次是脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸等,这与曲敏[7]的研究结果存在一定差异。
  曲敏[7]和冯叙桥等[27]通过β-消旋反应与血细胞凝集反应发现,GSGPs中存在O-连接糖肽键。
  王利锋等[17]检测到大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的分子质量约为4300u。李伟等[9]制得的GSGPs分子质量小于4000u,糖链通过GalNAc连接到丝氨酸或苏氨酸上,并具有-Galβ1-3GalNAcα-0-Ser/Thr结构。王文莉等[12]经时间飞行质谱测定表明,所制
备的大鲵肉酶解产物分子质量小于2000u,苯酚硫酸法测定糖含量为2%,Folin-酚试剂法测蛋白含量为93%。李伟等[8]经时间飞行质谱研究表明,以复合蛋白酶制备的大鲵黏液酶解产物分子质量小于4000u,苯酚硫酸法测定其为低聚糖肽。
      3.2 糖肽溶液共晶点及冷冻浓缩过程
  在制备大鲵糖肽干粉过程中,其溶液浓度较低,导致其冷冻干燥速度较慢。为了提高大鲵糖肽冷冻
干燥速度,需要研究它的共晶点、冻融过程及冷冻浓缩过程。佟长青等[28]采用电阻法测定了共晶点,结果表明,大鲵糖肽溶液共晶点为-3.6℃,缓慢融化时溶液中大鲵糖肽浓度逐渐降低,而搅拌速度对大鲵糖肽溶液冷冻浓缩效果影响较小。
      4 HPLC分析
  金桥等[21]使用SinoChromC18反相柱和紫外可变波长检测器,利用高效液相色谱方法对大鲵糖肽进行分析,结果表明,大鲵糖肽组分最佳检测条件为:检测波长280nm,流动相为乙腈∶甲醇∶0.1% 三氟乙酸=5∶5∶90,流速1.0mL/min,进样量20μL。
      5 应用
  张家界(中国)某大鲵生物科技有限公司研发了以GSGPs为主要成分的香鲵系列护肤品、仙鲵寇系列护肤品(塑颜洁面喱、塑颜新生精华水、塑颜紧致精华、塑颜紧致霜、隔离防护霜)、仙鲵寇娃娃鱼系列牙膏、GSGPs胶原蛋白果汁饮料。
      5.1 护肤品开发
  王睿等[22]制备了GSGPs润肤霜,并探讨了GSGPs的吸湿性和抗氧化性,以及GSGPs润肤霜的紫外线吸收性能及豚鼠皮肤涂抹的变态反应。研究表明,GSGPs在低湿度(RH =43%)和高湿度(RH =81%)条件下,吸湿率分别为3.8%和15.6%,GSGPs羟基自由基清除率达50.85%。GSGPs润肤霜对260~315nm紫外线显示较强吸收能力,其润肤霜稳定性符合QB/T1684—93要求,涂抹GSGPs润肤霜和GSGPs的豚鼠皮肤未出现任何红斑和水肿,与对照组豚鼠皮肤一致,30例人体受试者未发生任何不良反应[7]。
      5.2 饮料开发
  鲍九枝等[11]研制了大鲵肉活性肽运动饮料,其最佳制备工艺为料液比1∶7,柠檬酸0.4%,蔗糖10.0%,维生素C0.6%。曲敏[7]研制了GSGPs果汁保健饮料,并以pH值、沉淀率、感官评分和固形物含量为指标,优化后最佳制备工艺为GSGPs∶牡蛎多糖=1∶3,柠檬汁10mL,果胶含量0.1%,灭菌温度95℃,灭菌时间10min,黑加仑果汁∶蓝莓果汁=1∶3,所制得产品色泽、风味较佳,并具有良好的稳定效果。
      5.3 保健食品
  李伟等[29]研制了一种按质量百分比计有效成分为GSGPs10% ~80%、牡砺多糖1% ~50%、贻贝多糖1% ~50%、维生素C1% ~50%和牛磺酸1% ~50%的GSGPs保健食品,该配伍作用可明显增强免疫力、缓解体力疲劳,并具有抗高血压作用。动物试验结果表明,该保健食品无毒副作用,适用于体弱、免疫力低下及高血压患者长期服用。
     6 展望
     6.1 开发新的蛋白酶来源
  蛋白质资源利用的关键是酶技术的应用,不同酶具有不同的酶解位点,所得酶解产物的大小及生物活
性亦不同。目前,可选择的商品酶种类有限,这极大限制了大鲵蛋白资源的利用,因此新蛋白酶来源的开
发对大鲵蛋白资源利用研究具有重要意义。曲敏[7]应用海洋曲霉菌酸性蛋白酶对大鲵黏液进行水解,所制得的GSGPs具有抗氧化、抑制ACE活性、调节免疫功能等良好的生物活性。海洋中蕴含着丰富的微生物资源,随着海洋资源的进一步开发,海洋微生物逐渐成为新型酶制剂的重要来源[30],海洋微生物蛋白酶是其中重要的一种,可应用到大鲵蛋白质资源利用中。
      6.2 应用微生物发酵法制备大鲵生物活性肽
  目前,大鲵生物活性肽的制备主要应用单一酶或复合蛋白酶进行酶解。蛋白酶价格较高,且在生物活
性肽的制备中使用量大,加之养殖大鲵资源的珍贵,均会使大鲵活性肽成本极高而限制其实际应用。微
生物发酵法具有蛋白酶来源广、酶产量高、周期短、成本低等优点,且与酶法相比减少了蛋白酶的纯化和制备过程;另一方面,该方法可使蛋白水解及多肽脱苦同步进行,极大降低了生产成本,已作为制备生物活性肽的一种新方法[31]。李理等[32]利用液体发酵法制备了大豆蛋白多肽,肽得率为75%,比酶解法提高了10% ~20%,而成本仅为酶解法的50% ~60%。因此,可将微生物发酵法应用于大鲵生物活性肽的制备。
       6.3 利用DNA重组等技术提高大鲵生物活性肽产量
  大鲵作为一种珍贵生物资源,目前主要以大鲵黏液、皮肤、肌肉等组织为原料,依靠酶解技术获得大鲵生物活性肽,尽管其具有较佳的生理活性,但最终肽得率均不高,尚不能满足大鲵活性肽及其制剂产品的原料需求。随着基因工程技术的发展,可以利用DNA重组等技术将表达大鲵活性肽的基因整合到生
物体内,通过生物体表达出所需肽类,从而极大提高大鲵活性肽的产量和纯度。
      6.4 建立并规范大鲵多肽及制剂产品质量检测体系
  目前,有关大鲵活性肽的研究,主要集中于大鲵多肽及其制剂的制备工艺优化和相关生物学功能研
究,而在大鲵多肽及其制剂产品的质量检测上缺乏有效方法,还需进一步完善。一般而言,评定肽产品的
质量指标主要包括肽含量和肽分子质量的分布情况等。其中肽含量的测定可采用凯氏定氮法、双缩脲法、氨基酸法或隆丁分区法,肽分子质量分布的检测可使用超滤法、色谱法或电泳法[33]。在建立并规范
大鲵多肽及制剂产品质量检测体系过程中,可根据实际情况综合选取以上所述检测方法。
      6.5 大鲵生物活性肽的新功能开发及应用
  研究表明,大鲵生物活性肽具有肝损伤保护作用、抗氧化、抗疲劳、抗菌、抗紫外线、免疫功能调节、抑制ACE活性、抗皮肤光老化、抗血小板聚集等重要生理功能,并应用于护肤品、饮料及保健食品等中。而目前生物活性肽在药物、导向药物、药物先导化合物、疫苗、酶抑制剂及诊断试剂等中具有广泛的理论和应用价值[12]。相信随着研究手段和研究方法的不断深入和提高,尤其是随着蛋白质工程和酶工程技术的迅速发展,大鲵生物活性肽的研究,特别是免疫活性肽、抗癌活性肽等的研究,必将不断深入。
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