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寒地养殖
Cold farming

鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-01-30作者:admin浏览次数:80

      嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属于弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas),它是一种典型的“人-畜-鱼”共患病病原菌,引起多种水生动物感染发病[1-2]。研究结果表明,嗜水气单胞菌感染鱼类可导致烂鳃、赤皮病,斑点叉尾&套肠病、腹水病,鲤败血症、穿孔病,鳖白点病、白底板病、穿孔病,虾败血症等[3-8],给渔业经济造成了严重损失。此外,嗜水气单胞菌引起的哺乳动物、鸟类感染可导致人类食物中毒、腹泻、败血症等[1,3]。近几年,养殖鲫鱼病害频繁发生。本研究从患病鲫鱼(Carassiusauratus)体内分离纯化获得一株细菌CAH01,对其进行了细菌形态观察、生理生化特征鉴定、16SrDNA分子测序、药敏试验,旨在为嗜水气单胞菌引起疾病的预防治疗提供科学参考。
      1 材料
  患病鲫鱼来自河南省新乡市某水产养殖场,病鲫鱼体表有出血、鳞片脱落,鳃丝发红溃烂等临床症状;健康鲫鱼,购自河南师范大学水产养殖基地;细菌鉴定GenⅢ 96孔板,购自Biolog公司;LB固体培养基、细菌DNA提取试剂盒、PCRMasterMix等,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;药敏纸片,购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
      2 方法
      2.1 细菌的分离与纯化
  无菌操作取患病鲫鱼肝脏等组织涂布接种于LB固体培养基,28℃恒温培养24h;挑取典型的单个菌落划线接种,经2~3次传代得到纯菌种,接种试管斜面,4℃保存,备用。
      2.2 生理生化特性鉴定
  用8道移液枪将100μL适量菌液加到GenⅢ 96孔板,28℃孵育24h,通过细菌特征指纹图谱与BiologGenⅢ数据库中的菌种匹配鉴定结果。
      2.3 16SrDNA分子测序
  细菌基因组DNA提取参照参考文献[9]中的方法进行。PCR反应体系(总体积为20μL):通用引物(F5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3′,R 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1μL,DNA模板2μL,PCR MasterMix(Mg2+、Tag酶、dNTP,6×Buffer)10μL,ddH2O6μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用GoldviewⅠ型核酸染料染色观察。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16SrDNA序列测定,通过NCBI数据库BLAST检索进行序列相似性分析。
      2.4 人工感染与药敏试验
  参照参考文献[10]中的方法进行。随机选取健康鲫鱼10尾,在实验室饲养1周确认无病后用于感染试验。通过平板菌落计数法测定菌悬液浓度为1.0×109cfu/mL,人工腹腔注射0.4mL/尾,对照组鲫鱼注射等量无菌液体培养基,连续观察14d,统计鲫鱼发病死亡情况。采用Kirby-Bayer纸片扩散法进行药敏试验,用毫米尺量取抑菌圈直径,根据药敏纸片说明书,判定23种抗生素的敏感性。
      3 结果与分析
      3.1 细菌分离纯化及形态观察
  从患病鲫鱼肝脏中分离获得1株细菌,编号为CAH01,在LB固体培养基上菌落为圆形、边缘整齐、凸起,表面光滑,无色透明小菌落。镜检观察为革兰氏阴性短直杆菌。
     3.2 细菌生理生化鉴定
     CAH01菌株能够利用葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、蔗糖、果糖、半乳糖等,不能够利
用D-苹果酸、丙酸等,根据GenⅢ鉴定系统分析鉴 CAH01菌株革兰氏染色结果(×1000)
定表明,CAH01菌株与嗜水气单胞菌生理生化特征相似性为0.596,遗传距离为5.924,鉴定结果为嗜水气单胞菌。
      3.3 16SrDNA分析测序
  以提取细菌CAH01基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增其16SrDNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段在1300~1500bp之间,测序获得的16SrDNA片段长度为1351bp,BLAST比对显示与嗜水气单胞菌模式株ATCC7966(登录号为X60404.2)序列相似性为99%,这与GenⅢ鉴定系统的鉴定结果一致,最终鉴定CAH01菌株为嗜水气单胞菌。
      3.4 人工感染和药敏特性
  人工感染鲫鱼7d后发病率为100%,死亡率为80%,病鲫鱼与自然感染发病时症状基本相似,病鲫鱼主要表现为眼球突出,胸、腹、鳍基部充血明显,鳃丝发红溃烂,解剖鲫鱼有大量腹水,肠道充气透明,这符合细菌性败血症临床症状特征。同时,从频死鲫鱼肝脏中再次分离到与CAH01细菌形态一致的病原菌,而对照组鲫鱼观察14d无发病死亡现象。药敏试验结果显示,对庆大霉素、磺胺异唑、奈替米星、阿米卡星、头孢克肟、氯霉素、红霉素、新霉素、头孢噻肟、萘啶酸、头孢噻吩、卡那霉素、头孢哌酮、甲氧嘧啶、诺氟沙星、复方新诺明、头孢氨苄、呋喃妥因等18种抗生素高度敏感。
      4 讨论
  嗜水气单胞菌是引起鱼类细菌性败血症的病原菌之一,多数菌株是条件致病菌,可引起鱼、虾、蟹感
染发病[1]。孙其焕等[11]报道,嗜水气单胞菌感染异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)可导致溶血性腹水病;江开毓等[12]报道,嗜水气单胞菌感染鲤鱼(Cyprinuscarpio)可导致细菌性败血症。樊海平等[13]报道,嗜水气单胞菌感染中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)可导致败血症,引起大批死亡。文祝友等[14]报
道,嗜水气单胞菌感染三角帆蚌(Hyriopsiscumingii),引起蚌毁灭性死亡。杨臣[15]从患红脖病鳖中分离得到嗜水气单胞菌,可引起鳖患出血性肠道坏死症、腐皮病、疥疮病、烂板壳病等。陈怀青[16]报道,嗜水气单胞菌可以产生外毒素,具有细胞毒性,能够溶解人、兔、团头鲂等多种动物红细胞,从而导致机体发病,认为是一种典型“人-鱼-畜”共患的病原菌。本试验为了弄清鱼源嗜水气单胞菌生物学特征及其致病机理,2016年1月份从疑似患病鲫鱼肝脏中分离纯化得到CAH01菌株,采用GenⅢ鉴定系统并结合16SrDNA分子测序,最终鉴定CAH01菌株为致病性嗜水气单胞菌。
  张庆华等[17]从患病金钱鱼肝脏分离得到Ah201416菌株,经细菌生理生化分析、16SrRNA分子鉴定为嗜水气单胞菌,证实该菌对金钱鱼96h半数致死剂量(LD50)为7.35×107cfu/mL,病理切片分析表明:发病金钱鱼鳃小片细胞不同程度脱落,伴有白细胞浸润;肝脏细胞形态不规则,伴有红细胞浸润等病理损伤。周毅等[18]从发病金鱼肝脏中分离得到嗜水气单胞菌AH-TC菌株,经人工腹腔注射金鱼,48h死亡率为100%。肖丹[19]从患病银鲫体内分离得到嗜水气单胞菌JS01-JS17菌株,人工感染的死亡率达80%。本试验从患病鲫鱼体内分离得到一株致病性嗜水气单胞菌CAH01菌株,人工腹腔注射浓度为1.0×109cfu/mL,7d后鲫鱼死亡率为80%,病鱼症状为眼球突出,胸、腹、臀、鳍基部充血等。以上研究结果不仅对了解鱼源致病性嗜水气单胞菌生物学特性奠定了基础,而且为细菌性鱼病的预防治疗提供了科学参考。
  董忠典等[20]从罗非鱼(Oreochromisniloticus)肝脏中分离得到的2株嗜水气单胞菌(M-01、M-02)对庆大霉素、新霉素、氟罗沙星、恩诺沙星和复方新诺明等高度敏感。孙浩等[21]报道,大鲵水肿病病原菌嗜水气单胞菌AH1-21菌株对头孢唑林、头孢哌酮、阿米卡星敏感。宋德平等[22]从发病死亡金鱼体内得到的6株嗜水气单孢菌对氯霉素、复方新诺明、诺氟沙星等高度敏感。本试验从疑似患病的鲫鱼中分离得到的1株嗜水气单胞菌(CAH01)对头孢氨苄、头孢噻肟、头孢克肟、头孢噻吩、头孢哌酮、萘啶酸、诺氟沙星、磺胺异唑、复方新诺明、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、红霉素、新霉素、呋喃妥因、奈替米星、卡那霉素、甲氧嘧啶等18种抗生素具有高敏感性。以上研究提示,头孢菌素类、喹诺酮类及磺胺类等抗生素为优先考虑使用药物,在鱼类嗜水气单胞菌感染的临床治疗中具有借鉴意义。
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