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寒地养殖
Cold farming

常用抗生素对鸭疫里默氏杆菌MI最佳试验条件的确立

摘自:黑龙江畜牧杂志社发布时间:2018-02-05作者:admin浏览次数:949

    21世纪以来,随着养鸭业的快速发展和集约化程度的不断提高,鸭浆膜炎已成为制约养鸭业发展的
重要传染病之一。该病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的鸭、鹅、火鸡等禽类的一种高致病性、接触性传染病,死亡率可高达75%。本病最先发生于美国纽约长岛,随后英国、加拿大、澳大利亚、日本等相继报道有该病发生。现在,鸭浆膜炎
已在世界范围内广泛流行,发病率一般为60% ~70%,有时可高达90%[1-2]。在我国,自20世纪80年代报道北京地区首次发生鸭浆膜炎并分离到病原后,许多学者先后在广东、上海、四川等29个省市均分离到RA[1]。目前,国际公认的RA血清型有21个,各血清型之间缺乏交叉保护,使得不同国家和地区、同一地区不同时期或同一养殖场可同时存在多种血清型或亚型的混合感染[3-5]。由于疫苗使用的局限性,抗菌药在控制RA感染方面发挥了重要作用,但随着抗菌药物的广泛应用,导致RA耐药菌株不断
出现,直接威胁养殖业发展和人类健康,造成巨大经济损失[6-7]。
  由于实际生产中需要对分离到的RA进行药敏试验,测定常用药物对RA的最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC),明确RA的耐药状况,用来指导临床用药。因此,MIC的准确测定至关重要。虽然目前有许多关于药物对RAMIC的报道,但均没有详细的试验条件描述,只是简单说明测定了什么药物的MIC,结果是什么。
  本研究团队开展了大量的药敏试验,检测了多种抗生素对RA的MIC,试验中发现许多条件可以影响试验结果,比如不同生长时间段的RA、不同浓度的RA、不同培养时间等。有时检测同一种药物对同一株RA的MIC,若两次检测条件不一致,会对结果造成一定影响。笔者查阅了关于RA药敏试验的多篇文献,均没有最佳试验条件的详细描述[8-12],美国临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)亦没有对RA药敏试验的具体指导。鉴于此,试验研究了抗生素对RAMIC的最佳试验条件,目的是确保药敏试验得到准确的结果,用于正确指导临床用药。
     1 材料
     1.1 菌株
  RA-GD,分离自广东省,血清1型,强致病毒株;WF8,分离自山东省,血清1型,中等致病毒株;GN19,分离自广东省,血清10型,中等致病毒株;GN27,分离自广东省,血清10型,中等致病毒株。菌株均为经过两次纯化、-80℃保存的甘油菌种。
      1.2 主要试剂与仪器
  TSB,美国BD公司产品;DU730型分光光度计,购自BECKMAN COULTER公司;SKY-100B型摇床,购自上海苏坤实业有限公司;BIO-RAD680酶标仪,购自Bio-Rad公司。

       2 方法
       2.1 菌株的培养
  取出-80℃保存的上述RA甘油菌种,以1∶100的比例接种于含8%小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB),以37℃、200r/min过夜培养,培养时间约为10h;用接种环蘸取少量菌液,划线接种于含8%小牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂平板(TSA)上,置于37℃、含5% CO2 的培养箱中过夜培养(15~20h)。待平板上长成完整的单克隆菌落时,将平板放于4℃保存,备用。
     2.2 RA对数生长期的确定
  以RA-GD菌株为例:挑取2.1中制备的TSA平板上的单克隆,接种到含8%小牛血清的5mLTSB中,37℃、200r/min培养6~8h;取200μL菌液离心后用相同体积的1×PBS重悬,以1×PBS作为空白,调整菌液OD600值约为1.0(0.8~1.2),作为菌种。在5mL洁净培养管中加入2mLTSB培养基,取20μL上述菌液接种到培养基中(菌种与培养基的比
例为1∶100,菌液体积不计),平行做48个样品。第一天晚上放置13~24号和37~48号样品,第二天早上放置1~12号及25~36号样品,置于37℃摇床中培养,转速为200r/min。自培养开始计时,每隔1h取对应编号样品,4℃存放,依次取完全部样品。
  向96孔板中每孔加入270μLTSB培养基,在第1列的每孔从上至下依次加入1~8号RA-GD菌株30μL,混匀后用排枪从第1列的每孔中吸出30μL加入第2列,混匀,然后依次往后做10倍倍比稀释,稀释至1×10-12;每个样品从1×10-5(包含)的稀释度往后取样,根据不同培养时间确定两个最佳稀释度,取出50μL涂布在加有8%小牛血清的TSA上(每个稀释度的样品重复做2个平板),置于37℃、5% CO2的培养箱中培养(15~20h);待平板上长成完整的合适大小的白色单菌落时计数,取两个平板上的平均菌落数,结合《GB4789.2—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》,计算每个样品的菌落形成单位(cfu),并绘制RA-GD的生长曲线,生长30~300个菌落的平板对应的样品浓度为最佳稀释度。
      2.3 测定抗生素对RAMIC时的最佳用菌量
  选择兽医临床上常用的环丙沙星和恩诺沙星(喹诺酮类药物)、氟苯尼考(氯霉素类药物)、硫酸新
霉素和盐酸壮观霉素(氨基糖苷类抗生素)、多黏菌素B(多肽类抗生素),测定以上6种抗生素对4株
RA菌的MIC,确定MIC测定时的最佳用菌量。
  以RA-GD菌株为例,在96孔板上测定环丙沙星对RA-GD菌株的MIC,具体试验设计见表1。
  首先用排枪在96孔板的每孔内加入100μLTSB培养基。编号1~12代表96孔板的1~12列,在第一列的每孔内加入浓度为128μg/mL(配制浓度为1mg/mL的抗生素,使用前用灭菌水稀释至128μg/mL)的环丙沙星100μL,混匀后吸出100μL加入第二孔,依次往后做2倍倍比稀释,一直到第11列,吸出100μL弃去。如此,环丙沙星的浓度从第1列到第11列依次为64~0.0625μg/mL,每行的环丙沙星稀释度均相同。第12列不加抗生素,此时每孔有100μL液体。
  取对数生长期的RA-GD为受试菌。每个稀释度的菌株平行做2行重复。首先取8个5mL容量的
无菌离心管,每个管内加入2.7mLTSB培养基,准确吸取0.3mLRA-GD菌液,放入第1管中混匀,再吸出0.3mL放入第2管,依次往后做10倍倍比稀释,直至第8管。1~8管中菌液的稀释度依次为1×10-1~1×10-8。
  表中字母A~H代表96孔板的1~8行。A、B两行的每孔中加入1×10-1稀释度的菌液100μL,C、D两行各加入1×10-2稀释度的菌液100μL,E、F两行的每孔中加入1×10-3稀释度的菌液100μL,G、H两行为梯度浓度的抗生素对照,每孔加入TSB100μL。第12列为菌液和培养基对照,每个对照均设2个重复。
  将96孔板放于37℃、含5% CO2的培养箱中过夜培养(15~20h);用BIO-RAD680酶标仪以600nm波长测定吸光度。培养基对照应清澈无菌,菌株对照应生长到对数生长期。以肉眼观无菌生长,OD600值与对应的抗生素对照孔的OD600值接近一致的孔所对应的抗生素浓度判定为MIC。
  测定其他5种抗生素对RA-GD菌株的MIC,以及6种抗生素对WF8、GN19、GN27菌株的MIC,都依据以上方法进行。
  测出抗生素对每株菌在不同稀释度时的MIC,以测定的MIC最稳定时的菌液稀释度为最佳用菌量。
     2.4 测定MIC最佳时间的确定
  确定环丙沙星对RA-GD菌株MIC时的最佳检测时间。参照表1设置环丙沙星梯度浓度及各对照,以最佳用菌量作为受试菌,平行做6个平板。将96孔板放在37℃、含5% CO2的培养箱中过夜培养(14~24h)。从培养的第14小时开始检测MIC,每间隔2h取1个平板测定MIC。以菌株对照达到对数生长期,所测定的MIC最稳定的时间段作为最佳检测时间。
     3 结果与分析
     3.1 RA对数生长期的确定结果
  参照《GB4789.2—2010食品安全国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》对各平板计数,换算为cfu/mL。不同培养时间的菌液进行10倍倍比稀释后,涂布到TSA平板上,计算TSA平板上菌落个数在30~300cfu时所对应的菌液浓度为最佳稀释度,见表2。
  以cfu的对数lb为纵坐标,以培养时间t为横坐表2 不同培养时间的菌液涂布TSA平板所对应的最佳稀释度培养时标,绘制RA-GD的生长曲线,见图1。图1 RA-GD菌株培养48h的生长曲线Fig.1 ThegrowthcurveofRA-GDstraincultured
for48hours
  通过对细菌菌落数取以2为底的对数,建立培养1~48h的生长曲线,结果表明,RA-GD菌株的对数期为培养后1~6h,6小时后进入平台期,并持续至第36小时。随后活菌数缓慢下降,细菌进入衰亡期。RA-GD、WF8、GN19和GN27培养1~8h的OD600值与cfu(lb)的线性关系见图2。
  用SPSS17.0软件拟合直线,对RA-GD、WF8、GN19、GN27在1~8h的OD600值与进行分析,发现二者之间存在良好线性关系。GN27的OD600值与cfu(lb)之间存在较好线性关系。对各组双变量[OD600值和cfu(lb)]进行相关性检验,Pearson相关系数分别为0.969,0.969,0.984,0.928,在0.01水平(双侧)上显著相关。证明在对数生长期,RA菌株OD600值与cfu(lb)有良好的线性关系。
  依据以上方法,分别测定另外3株菌WF8、GN19、GN27在培养1~8h的cfu(lb)和OD600值,建立二者对应关系,见表3。
  表3描述了RA-GD在培养后6小时到达平台期,WF8、GN19和GN27在7小时到达平台期,同时呈现了4株菌在培养1~8h的菌落数与OD600值的对应关系。数据显示,OD600值约为1.0时菌落数可达1×1011~1×1012cfu/mL。进入平台期,菌量最高可达1×1012cfu/mL。初始接菌量不同,各菌株培养到达平台期的时间不尽一致。
     3.2 测定抗生素对RAMIC时的最佳用菌量
  分别测定6种抗生素对4株RA的MIC,以不同稀释度的菌液作为受试菌,检测结果见表4。
  由表4可知,在6种抗生素对4株RA的MIC测定试验中,在1×10-1 ~1×10-8的8个菌液稀释度中,1×10-5可获得最稳定的MIC数值,作为最佳稀释度。运用该方法确定细菌的最佳稀释度参照P.C.Hannan[13]的报道。
     3.3 MIC最佳测定时间的建立
  4株菌在不同培养时间测定的OD600值及MIC见表5。
  由表5可知,以最佳稀释度为1×10-5的RA菌液作为受试菌,测定环丙沙星对RA-GD等菌株的MIC,发现随着培养时间的增加,MIC会发生相应变化。数据显示,RA-GD、WF8、GN19、GN27在20~24h内MIC数值恒定。此外,菌株对照OD600值随培养时间增加亦相应增大,22~24h趋于稳定,表明此时细菌已进入平台期。因此,结合对照OD600值变化,读取相应时间内环丙沙星对4株RA的MIC,可知在20~24h对环丙沙星作用于RAMIC的判定有意义,22~24h为最佳测定时间。
      4 讨论
     目前,尽管有文献报道了多种抗生素作用于RA的MICs,但对MIC判定的具体试验过程均没有详细描述。在进行药敏试验时发现,试验条件不一致,会干扰抗生素对RAMIC的准确判定,对试验结果造成影响。为测得准确的MIC,有必要对抗生素作用RA时的试验条件进行规范。因此,本试验开展了相关研究,以确定抗生素对RAMIC时的最佳试验条件。
  大肠埃希氏菌作为标准株常规获得的最终接种浓度为5×105cfu/mL。本试验中,RA生长到达对数生长期后期时,菌液的OD600值在0.8~1.2之间,活菌数可达1×1011 ~1×1012 cfu/mL,以最佳稀释度1×10-5的RA菌液作为受试菌,相应细菌浓度为1×106~1×107cfu/mL,较标准中大肠杆菌最终接种浓度大2~20倍。RA作为兼性厌氧菌,在37℃、含5% CO2条件下培养22~24h可获得对MIC的最佳判定,与普通菌株采用肉汤稀释法在(35±2)℃培养20~24h的结果大致相同。而本试验采取生长至对数期的RA作1×10-5稀释后直接作为受试菌,较标准中推荐的5×105cfu/mL更为简便。
  本试验规范了抗生素对RAMIC的最佳试验条件,可确保得到的MIC值比较准确,对临床用药具有实际指导意义,可供广大临床兽医工作者及相关研究人员参考。

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