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寒地养殖
Cold farming

红褐色乌苏里貉Agouti基因第二外显子的克隆及多态性分析

摘自:黑龙江畜牧兽医杂志社发布时间:2018-02-26作者:admin浏览次数:1124

       貉(Nyctereutesprocyonoides)在动物学分类上属于哺乳纲食肉目犬科貉属[1],是一种珍贵的毛皮动物。我国貉可分为3个亚种,即指名亚种、东北亚种和西南亚种,目前东北亚种是我国人工饲养量较大、经济价值较高的一种,以乌苏里貉为主,主要产于三江平原、大兴安岭、南北平原等地,其被毛颜色多为青灰色[2]。2006年,在山东临沂发现的一种突变型乌苏里貉,其变异表现为毛尖呈红褐色、白底绒毛色,且眼睛呈粉红色,因此将其称为红褐色乌苏里貉。这种新的突变毛色优于一般乌苏里貉毛皮的手感且颜色美观特殊,因此相对于一般乌苏里貉具有更大的经济价值。而这种新突变毛色的基因与白貉基因显隐性的相关性、其纯合是否致死及该基因的分子遗传基
础、最佳选配方式等问题都需要更进一步的研究。动物的毛色是由多种基因相互作用控制的,其中Agouti基因是控制毛色的主要基因之一。Agouti基因,即鼠灰色基因,不是单一位点,而是一个含有多个等位基因的位点[3-4],其结构复杂,由4个外显子和3个内含子组成,外显子1为非编码序列,外显子2,3,4为编码序列[5-6]。有研究表明,纯化小鼠Agouti信号蛋白(AgoutisignaIprotein,ASIP)与黑MC1R有高度的亲和力,拉开了研究Agouti信号蛋白多效性机制的序幕。有研究者发现,Agouti相关蛋白(ASIP)与黑皮素受体(MC1R)有高度的亲和力,ASIP和α-促黑素(α-MSH)竞争性地与MC1R结合,有效阻滞了α-MSH下游的信号传导从而抑制黑素合成[7]。体外黑素细胞培养试验证实,细胞培养中加入ASIP与α-MSH合成相颉颃,可以抑制黑素细胞内的腺苷-3′,5′-环化-磷酸(cAMP)水平升高同时也可抑制酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)的表达,从而达到降低黑素合成的目的。目前,发现小鼠的Agouti基因有5种显性突变,这些突变导致ASIP异位过度表达,如致死黄突变等,表现为鼠毛皮颜色变浅;某些突变将导致ASIP的表达减少,如Agouti丢失突变、黑褐突变、致死性Agouti丢失突变等都将导致褐黑素合成减少、真黑素合成增多。有研究表明,Agouti基因可以编码一种旁分泌信号分子即ASIP,这种信号蛋白使毛囊黑色素细胞合成褐黑素而非真黑素。ASIP以一种竞争性方式对黑色素细胞刺激激素受体起颉颃作用,从而调节真黑素和褐黑素之间的转换。J.A.Kerns等[8]通过对褐色德国牧羊犬和黑褐色相交毛色德国牧羊犬的Agouti基因cDNA进行克隆测序发现,在96bp处一个T→C导致犬的被毛由黑色变为棕色。付冬丽等[9]选取野猪被毛为黑色、棕黄色、银
棕色的个体各5头,提取的基因组DNA混合成的DNA池为PCR扩增模板,设计Agouti基因的5对引物进行扩增、纯化和测序,在Agouti基因的3′-UTR区域发现一个T→C的突变位点,这个结果与一些哺乳动物的研究结果很相似,推测这可能是导致野猪白毛色形成的原因。另外,在绵羊的Agouti基因中检测到Agouti基因编码区缺失突变和置换突变各1处,缺失突变位于第二外显子,导致移码突变,使该基因编码蛋白提前终止为63个氨基酸,转换突变位于第四外显子,T→A使编码氨基酸发生改变,由半胱氨酸转变为丝氨酸(Cys→Ser)[10]。目前,对于Agouti基因的研究已经深入到许多动物中,但在乌苏里貉中的研究尚未见报道。试验以野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉作为研究对象,对Agouti基因的第二外显子进行克隆测序,并分析其多
态性及与其他物种的同源性,以期为乌苏里貉Agouti基因的后续研究提供参考。
       1 材料
       1.1 试验动物
       试验选取野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉各3只(试验动物来自山东青岛市莱西万盛农牧有限公
司),将毛皮组织置于75% 乙醇中,-20℃保存,备用。
      1.2 主要试剂及试剂盒
       基因组DNA提取试剂盒,北京全式金生物技术有限公司生产;DNA胶回收试剂盒,上海生工生物工程技术服务有限公司生产;蛋白酶K、pMD19-T、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄、TaqDNA聚合酶、琼脂糖、DL-5000Marker、替代型核酸染色剂,均购自宝生物工程(大连)有限公司。
       2 方法
       2.1 基因组DNA的提取
        按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,提取2种貉的基因组DNA,提取的DNA于-20℃保存,备用。
       2.2 引物的设计
        根据NCBI查询到犬Agouti基因序列(登录号为NC_006606.3),利用PrimerPrimier5软件设计引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
       2.3 PCR扩增
        以提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。PCR扩增体系(50μL):5mmol/LdNTPMix4μL,10×Buffer5μL,10μmol/L上、下游引物各2μL,100ng/μLDNA模板2μL,5U/μLTaqDNApolymerase1μL,加入双蒸水补至50μL。于离心机中微离心,置于PCR仪中进行扩增,扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性45s,57℃退火40s,72℃延伸45s,共32个循环;72℃再延伸10min;4℃保存。
       2.4 琼脂糖凝胶电泳
       采用1%琼脂糖平板电泳检测PCR产物。在1×TAE缓冲液中,以110V的电压进行电泳25min,通过UVP凝胶成像系统观察并照相。
       2.5 基因片段的回收、纯化及测序
       PCR产物经回收、克隆、转化、筛选,送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
       3 结果与分析
       3.1 DNA的提取及鉴定
       试验选取野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉,用试剂盒提取基因组DNA,提取的基因组DNA经凝胶电泳检测,条带清晰可见,OD260/OD280值在1.7~1.9之间,表明质量良好,可用于后续试验。
       3.2 PCR扩增
       扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后得到的扩增片段长度约为437bp,片段大小与本试验预期结果一
       3.3 测序结果及多态性分析
       阳性克隆经上海生工生物工程技术服务有限公司测序后得到目的序列,经DNAMAN软件处理后得到长度为156bp的Agouti基因第一外显子序列,利用DNAMAN软件对野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉的序列进行对比分析,结果表明,红褐色乌苏里貉M.DL-5000Marker;1~3.野生型乌苏里貉;4~6.红褐色乌苏里貉。野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉Agouti基因的PCR电泳结果与野生型乌苏里貉序列与犬相比,在第13bp和15bp处存在差异,红褐色乌苏里貉序列与野生型乌苏里貉相比,在130bp碱基处由G突变为T导致其编码的氨基酸由色氨酸变为甘氨酸。
       3.4 序列碱基组成分析
        犬和野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉Agouti基因第二外显子序列对比结果
  利用DNAMAN软件分别对野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉和犬Agouti基因第二外显子序列碱基组成进行分析,结果表明:野生型乌苏里貉的A+T含量为47.77%,G+C含量为52.23%;红褐色乌苏里貉的A+T含量为48.41%,G+C含量为51.59%,两者G+C含量均大于A+T含量,而且2种貉与犬第二外显子的碱基组成差异不大。
      3.5 同源性比较与分析
       红褐色乌苏里貉与其他物种Agouti基因第二外显子进行BLAST分析结果表明,与犬的同源性为93.94%,与家猫的同源性为83.33%,与黑猩猩的同源性为80.47%,与野猪的同源性均为78.57%,与马的同源性均为80.36%,与绵羊的同源性为77.98%,其中与犬的同源性最高,这就为以犬Agouti基因序列作为参照研究乌苏里貉Agouti基因提供了理论依据。
       4 小结与讨论
       4.1 Agouti基因多态性与毛色的关系毛色形成是由多个基因与环境共同作用来调控的,但是毛色相关基因的突变有可能是导致动物毛色变化的主要原因。试验对Agouti基因序列及多态位点进行分析研究,有助于更好地了解Agouti基因对红褐色乌苏里貉毛色的影响。
       4.2 Agouti基因保守性
       试验成功克隆了野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉Agouti基因第二外显子。序列对比发现,野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉第二外显子与犬第二外显子序列具有高度同源性,说明该序列的保守性良好,这就为以犬Agouti基因序列为参照对乌苏里貉Agouti基因后续研究中提供了理论依据。对野生型乌苏里貉和红褐色乌苏里貉Agouti基因第二外显子进行序列对比分析,结果表明,红褐色乌苏里貉与野生型乌苏里貉相比在130bp碱基处由G突变为T,导致其编码的氨基酸由色氨酸变为甘氨酸,这可能是导致红褐色乌苏里貉毛色突变的原因。
       4.3 影响乌苏里貉毛色的原因
       多种原因导致了红褐色乌苏里貉毛色的改变,其中毛色基因是主要的因素。
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